Immunologia ricomposta

Le sbobine seguono l'ordine in cui le lezioni sono state tenute, con due docenti che si alternano: il prof. Annunziato tratta l'immunità innata e l'ontogenesi T, la prof.ssa Monti l'immunità acquisita e la risposta umorale. Il risultato è che lo stesso argomento ricompare in tre o quattro lezioni diverse, ogni volta a un livello di dettaglio differente, e che alcuni concetti vengono usati molte pagine prima di essere spiegati.

Qui il materiale è stato riordinato per argomento, seguendo la progressione con cui l'immunologia si capisce: prima le barriere, poi chi sono le cellule, poi come l'innata riconosce, poi come l'adattativa riconosce, infine come entrambe uccidono. Le ripetizioni fra lezioni sono state fuse in un unico passaggio, tenendo il dettaglio maggiore fra le versioni disponibili. Ogni capitolo porta l'indicazione delle lezioni da cui proviene.

Le quattro etichette

La protezione dell'organismo si organizza su due livelli sequenziali, non alternativi:

1. Difese fisiche e biochimiche — cute e mucose, cioè le superfici che delimitano l'organismo dall'ambiente esterno.
2. Sistema immunitario — entra in gioco solo se la barriera viene interrotta e il microbo penetra.

Fino a pochi anni fa la barriera veniva pensata come puramente meccanica. Oggi si sa che è attiva: le cellule che la compongono non sono inerti verso il microbo, ma mettono in atto meccanismi che ne ostacolano l'ingresso e la replicazione.

Dentro il secondo livello si aprono a loro volta due sottolivelli — immunità innata e immunità acquisita — trattati nel capitolo 04.

Cute

• Barriera fisica in senso stretto.
• Rinnovamento dello strato corneo: lo strato più esterno viene ricambiato continuamente e porta via i microbi e le sostanze depositate.
• pH basso, dovuto alle secrezioni delle ghiandole sebacee e all'acido lattico delle ghiandole sudoripare: ostacola la sedimentazione dei microbi.
• Peptidi antimicrobici prodotti dai cheratinociti, che ostacolano la replicazione.

Mucose

Ogni mucosa ha meccanismi propri, ma tutte condividono la produzione di muco e di peptidi antimicrobici.

Agenti solubili delle secrezioni

• Lisozima.
• Glicoproteine che ostacolano la replicazione virale e batterica.
• Chelanti del ferro: sottraendo ferro impediscono la replicazione di molti microbi.

Le "sostanze estranee" verso cui il sistema immunitario reagisce si chiamano più correttamente antigeni. Il termine nasce dall'osservazione che iniettando in un animale da laboratorio una sostanza estranea compaiono nel siero dei corpi — gli anticorpi: da qui antigene, generatore di anticorpi (Ladislas Deutsch).

Classificazione per origine

Il vocabolario che serve per tutto il resto

La disposizione spaziale degli epitopi sulla superficie dell'antigene condiziona il legame: possono essere sovrapposti, non sovrapposti, più o meno distanti, o darsi interferenza sterica a vicenda.

Natura del determinante

• Determinante conformazionale: dipende dal ripiegamento tridimensionale; si perde con la denaturazione. Un anticorpo specifico per la forma nativa può non legare la proteina denaturata.
• Determinante lineare: è la sequenza amminoacidica. Può essere accessibile nella proteina nativa oppure nascosto e reso disponibile solo dopo denaturazione o proteolisi.

Perché il sistema può ammalarsi di sé stesso

L'immunità viene definita come "reazione dell'organismo verso sostanze estranee", ma la definizione non è del tutto vera. Il sistema immunitario reagisce verso una sostanza: se questa è estranea, il risultato è quasi sempre protezione; se è parte dell'organismo, il risultato è una patologia autoimmune.

La differenza sta nella persistenza. Se l'antigene è estraneo e la risposta è efficiente, l'antigene viene eliminato e l'attivazione si spegne. Se l'antigene è una molecola self, non può essere eliminata: il sistema continua a reagire e si instaura un'infiammazione cronica. Esempio: la reazione contro la proteina basica della mielina, impossibile da eliminare, determina la sclerosi multipla.

Il sistema immunitario è dunque un complesso di cellule e molecole — una componente cellulare e una umorale — che operano in modo coordinato e sono responsabili dell'immunità.

Immunità naturale (nativa, innata)

Componenti presenti in tutti i tessuti, attivate dall'esposizione ad agenti esterni grazie a recettori monomorfi (non clonali). È presente anche negli invertebrati: è la più antica filogeneticamente.

"Monomorfo" significa che a un gene corrisponde un recettore, sempre identico: il recettore per il lipopolisaccaride è lo stesso che sia espresso da un macrofago, da una cellula dendritica, da un neutrofilo o da un eosinofilo. Il sistema si è evoluto con centinaia di recettori diversi, ciascuno con specificità per strutture condivise da più patogeni: chi riconosce il lipopolisaccaride, chi il mannosio, chi gli acidi nucleici. Esistono anche recettori solubili nei liquidi biologici: la proteina C reattiva è uno di questi, e aumenta nel siero in risposta all'infiammazione.

Immunità specifica (acquisita, adattativa, clonotipica)

Componenti presenti principalmente nei tessuti linfoidi, attivate grazie a recettori clonali altamente specifici: si espandono in modo specifico e, a una seconda esposizione allo stesso agente, agiscono più efficacemente (memoria). Presente nei vertebrati, massima complessità nei mammiferi.

"Clonale" significa che ogni singola cellula ha un recettore unico. Se si prendono 10 linfociti T da una persona e si analizza il locus del recettore per l'antigene, si trovano 10 recettori diversi, a meno che non derivino dalla stessa cellula madre. Il repertorio è dell'ordine di 10¹² specificità diverse, ma il genoma non contiene abbastanza geni per 10¹² proteine: deve esistere un sistema che diversifica il prodotto a partire dallo stesso locus. È la ricombinazione somatica (cap. 24).

Il prezzo del repertorio ampio è che, più è ampio, maggiore è la probabilità di generare recettori reattivi verso il self: il sistema non può controllare in anticipo verso cosa innesca la specificità. Linfociti autoreattivi vengono prodotti continuamente ed eliminati dai meccanismi di tolleranza.

Il confronto, in tabella

Le due immunità collaborano, non si succedono soltanto

La prima e più importante collaborazione riguarda il linfocita T: a differenza del linfocita B, non è in grado di riconoscere l'antigene in forma diretta. Ha bisogno che l'antigene venga catturato da popolazioni dell'immunità innata (e dai linfociti B), processato e associato a MHC di classe I o II. Solo allora il linfocita T prolifera, diventa cellula effettrice e produce citochine che a loro volta stimolano le cellule dell'innata e i linfociti B. La sequenza è circolare: innata → adattativa → innata.

La "memoria" dell'immunità innata: trained immunity

Il concetto di memoria è stato storicamente riservato all'immunità specifica, ma si è osservato che anche l'innata mostra una simil-memoria ("cellule trained", educate). Alcune popolazioni di cellule NK, pur esprimendo solo recettori monomorfi, sopravvivono a lungo dopo l'incontro con un microbo. La dimostrazione più chiara riguarda il citomegalovirus: nei soggetti sieropositivi per CMV si trovano popolazioni NK espanse e particolarmente reattive verso il virus, assenti nei sieronegativi. Non è la memoria clonale dell'adattativa, ma è un'impronta lasciata dall'infezione.

Il primo esempio documentato di memoria immunologica è la descrizione che Tucidide fa nel 430 a.C. dei sopravvissuti alla peste di Atene: potevano curare i malati senza contrarre la malattia una seconda volta.

La curva anticorpale

L'esperimento tipo: si immunizza un soggetto vergine con la tossina tetanica e si dosano ogni 24 ore gli anticorpi specifici nel siero.

• Risposta primaria: picco dopo circa 15 giorni (le sbobine danno anche 7–10 giorni per la prima comparsa misurabile). È il tempo necessario perché i linfociti B proliferino e costituiscano il clone che produce l'anticorpo specifico.
• Eliminato l'antigene, i livelli sierici scendono, ma non tornano mai al basale: sono state prodotte le cellule B della memoria.
• Risposta secondaria (o anamnestica): reimmunizzando dopo 5–6 settimane, l'incremento è più rapido (1–3 giorni) e il picco decisamente più alto.

La differenza non è solo quantitativa: cambia anche la qualità dell'anticorpo, che diventa più affine e di classe diversa (cap. 32).

Che cosa sono le cellule a lunga sopravvivenza

Si parlava di cellule a lunga sopravvivenza da almeno quarant'anni senza sapere spiegare come potessero vivere così a lungo. Nel 2011 Gattinoni dimostra che, quando un linfocita T risponde all'antigene e inizia l'espansione clonale, una parte delle cellule figlie — con un meccanismo simile alla divisione asimmetrica di una cellula staminale — mantiene un grado di staminalità. Il clone si divide dunque in due destini: cellule effettrici terminali che eliminano il microbo, e cellule quiescenti e staminali, caratterizzate da:

• lunga sopravvivenza (decenni);
• alto potenziale di memoria: essendo numericamente più rappresentate del clone di partenza, al secondo incontro danno un'esplosione proliferativa molto maggiore;
• capacità di autorinnovamento, perché la divisione asimmetrica si riinnesca.

Le cellule della memoria non risiedono solo negli organi linfoidi e nel midollo osseo: una parte è residente nei tessuti, dove aiuta l'immunità innata a controllare l'infezione, ed è identificabile per l'espressione di recettori particolari. È un concetto recente che ha cambiato il quadro classico.

La prima manipolazione storica del sistema immunitario è il vaccino di Edward Jenner (fine '700). Jenner nota che le mungitrici, continuamente esposte al vaiolo vaccino (virus dei bovini), sono molto più protette dal vaiolo umano. Inocula in un ragazzo il pus di una pustola di vaiolo vaccino e, un paio di settimane dopo, gli inocula il vaiolo umano: il ragazzo risulta protetto. È il primo esempio di vaccinazione.

Il meccanismo è la memoria verso un antigene condiviso fra i due virus: un soggetto immunizzato per il vaiolo vaccino è protetto anche verso quello umano, sia sul versante cellulare (linfociti T) sia su quello umorale (anticorpi). Fra le funzioni degli anticorpi c'è la neutralizzazione: se l'anticorpo è specifico proprio per la molecola che il virus usa per infettare la cellula, lo rende inefficace.

Attiva e passiva

Immunizzazione passiva con cellule: l'applicazione clinica

Identificare, all'interno di un clone antigene-specifico, la cellula capace di sopravvivere a lungo permette di fornire un'immunizzazione passiva con cellule. L'esempio classico è il trapianto di midollo osseo:

• Un trapianto è istocompatibile al 100% solo fra gemelli omozigoti; negli altri casi si innesca una reazione verso le cellule trapiantate.
• Per evitare il rigetto il ricevente viene immunoablato: gli si elimina il sistema immunitario e gli si fornisce midollo per ricostruirne uno nuovo.
• La ricostituzione richiede settimane o mesi. Storicamente la maggior parte dei pazienti moriva non per la reazione al trapianto, ma per la riaccensione di infezioni banali e diffusissime: citomegalovirus, herpes.
• Oggi gli antivirali coprono in parte quella finestra; la linea di ricerca attuale è selezionare dal donatore linee di cellule T specifiche per antigeni virali, congelarle e infonderle quando il trapiantato sviluppa l'infezione.

CAR-T

La stessa logica applicata agli antigeni tumorali dà le CAR-T (chimeric antigen receptor T cells). "Chimerico" perché il recettore combina due cose: la capacità di un'immunoglobulina di riconoscere l'antigene in forma diretta, montata sulla membrana di un linfocita T citotossico. Quando la cellula che esprime il recettore chimerico riconosce l'antigene, uccide il bersaglio. Sono estremamente efficaci: in ore–giorni dall'infusione la componente neoplastica può essere eliminata.

Gli organi linfoidi sono tessuti organizzati che contengono un elevato numero di leucociti. Il termine leucociti indica tutte le cellule del sistema immunitario, i globuli bianchi, poi classificati in sottopopolazioni funzionali molto precise.

Negli organi linfoidi i leucociti interagiscono con cellule non linfoidi, dette in senso lato cellule stromali. Non sono meno importanti: è dimostrato che lo stroma supporta non soltanto la differenziazione nelle varie sottoclassi, ma anche la sopravvivenza, la proliferazione e l'assunzione di funzioni precise.

Organi linfoidi primari (centrali)

Dove i leucociti si sviluppano.

• Midollo osseo — sostituito nelle sue funzioni, durante la vita fetale, dal fegato fetale. Contiene la cellula staminale ematopoietica, da cui scaturiscono tutte le popolazioni: non solo leucocitarie, ma anche globuli rossi e megacariociti. È l'organo che si trapianta a un soggetto immunoablato.
• Timo — dove maturano i linfociti T, a partire da precursori linfoidi migrati dal midollo.

Organi linfoidi secondari (periferici)

Dove i linfociti maturi incontrano l'antigene.

• Tonsille: palatine, faringo-adenoidi, linguali, tubariche.
• Linfonodi.
• Milza — raccoglie gli antigeni penetrati nel torrente circolatorio, sia direttamente dai tessuti sia per via linfatica attraverso il dotto toracico.
• MALT, sistemi linfoidi associati alle mucose, bronchiale e intestinale, con strutture organizzate (es. placche del Peyer).
• SALT, sistema linfoide associato alla cute: più diffuso e meno organizzato di quello mucosale, ma con popolazioni leucocitarie stanziali pronte a innescare la risposta.
• Tessuti linfoidi ectopici: tessuti linfoidi che si formano de novo in organi non linfoidi, di norma in risposta a un insulto.

Struttura del linfonodo, funzionalmente

Le lezioni 10 e 11 descrivono il linfonodo dal punto di vista dei movimenti cellulari:

• Vaso afferente → porta la linfa drenata dalla periferia, potenzialmente ricca di antigeni, nel seno sottocapsulare.
• Regione corticale con i follicoli: ricchi di linfociti B. Follicolo primario = quiescente; follicolo secondario = con centro germinativo attivo.
• Zona paracorticale: ricca di linfociti T e cellule dendritiche presentanti l'antigene.
• Venule ad endotelio alto (HEV): la porta d'ingresso dei linfociti dal sangue.
• Vaso linfatico efferente: l'uscita.

Come entrano gli antigeni nel follicolo

• Antigeni piccoli: entrano direttamente nei condotti che dal seno sottocapsulare portano la linfa ai follicoli, dove i B li riconoscono in forma nativa.
• Antigeni grandi, che non attraversano i condotti: (a) captati dai macrofagi del seno sottocapsulare, che li portano al follicolo senza processarli; (b) portati dalle cellule dendritiche del seno midollare.
• Immunocomplessi che hanno legato componenti del complemento: nella milza vengono catturati dai linfociti B della zona marginale, dotati dei recettori per quelle frazioni.

La cellula staminale ematopoietica risiede nel midollo osseo, ma si trova anche in circolo a frequenze inferiori allo 0,001%: la si identifica con la citofluorimetria, analizzando centinaia di migliaia di eventi al secondo, grazie a due marcatori specifici, CD34 e CD133.

Applicazione clinica: evitare l'aspirato midollare

I due precursori

Nel midollo, in risposta a citochine prodotte dallo stroma e a fattori di crescita e differenziazione, la staminale si polarizza verso due precursori. La distinzione è fondamentale perché la risposta immunitaria dipende strettamente dall'essere una cellula linfoide o mieloide.

I fattori di trascrizione che orientano il precursore linfoide sono, per la linea B, EBF, E2A e Pax5; per la linea T il segnale decisivo è NOTCH1 stimolato dal ligando Delta1 timico (cap. 25); il bivio fra linea T/B e compartimento innato è segnato dal fattore ID2, che indirizza verso NK/ILC. L'ambiente citochinico, i fattori locali e modificazioni epigenetiche come i microRNA (piccoli RNA endogeni non codificanti che bloccano l'mRNA) concorrono alla scelta.

Il traffico è a doppio senso

Tutte queste cellule circolano fra organi linfoidi primari e secondari attraverso sangue e linfa. Fino a pochi anni fa si riteneva che, una volta uscite dagli organi primari, le cellule differenziate non potessero rientrarci. Si è invece dimostrato — almeno per il midollo osseo — che una quota di cellule già differenziate, dopo aver risposto all'antigene, torna nel midollo, dove trova nicchie particolari costituite dallo stroma e diventa cellula a lunga sopravvivenza. È il substrato anatomico della memoria immunologica.

Monociti

• 2–8% dei leucociti del sangue; diametro 10–18 μm.
• Citoplasma abbondante (li distingue dai linfociti), nucleo reniforme; contengono mitocondri, RE, Golgi, lisosomi e due tipi di granuli: primari (precoci, fosfatasi acida e perossidasi) e secondari (tardivi, catalasi).
• Sono cellule in transito: forma indifferenziata del macrofago, differenziano a macrofago una volta raggiunto il tessuto, in risposta a citochine infiammatorie.

Diapedesi

Richiamati da citochine chemioattraenti prodotte nella sede del danno, i monociti migrano dal circolo al tessuto. Per aderire all'endotelio devono prima essere rallentati: sono ancora le citochine a stimolare l'endotelio a esprimere selectine e integrine, che rallentano le cellule circolanti (fenomeno del rolling leucocitario) e ne mediano l'adesione.

Macrofagi

Cellule mononucleate tissutali del sistema dei fagociti. Hanno due ruoli, in due immunità diverse:

Nomi diversi secondo il tessuto

Doppia origine dei macrofagi tissutali

La visione classica sta cambiando: si ritiene che coesistano macrofagi di derivazione monocitaria, con ricambio continuo, e macrofagi di derivazione embrionale, mantenuti nel tessuto da cellule staminali locali. La dimostrazione nell'uomo viene dal monitoraggio di organi trapiantati fra sessi diversi: se il donatore è femmina e il ricevente maschio, nell'organo si trovano macrofagi sia XX (residenti, dell'organo) sia XY (derivati dai monociti del ricevente).

Nell'infiammazione cronica granulomatosa

I macrofagi si accumulano attorno alla zona d'infezione trasformandosi in cellule epitelioidi, che disposte in corona costituiscono una sorta di capsula. Non è raro che fondano fra loro formando cellule giganti polinucleate dette cellule di Langhans.

Attivazione del macrofago

Il macrofago non attivato viene stimolato da microrganismi, ligandi dei TLR e citochine. Una volta attivo aumentano: metabolismo, velocità di diffusione, dimensioni, numero di granuli, endocitosi, capacità di killing, numero di recettori, produzione di citochine.

Recettori dei monociti/macrofagi

Cellule dendritiche

Globuli bianchi che risiedono per lo più nei tessuti: solo lo 0,5% è in circolo. Si trovano soprattutto nei tessuti di barriera, più facilmente raggiungibili dai patogeni: mucosa nasale, polmonare, intestinale, gastrica e cute. Qui sono le sentinelle del sistema immunitario: le numerose estroflessioni ne aumentano la superficie e le rendono specializzate nel riconoscimento e nella cattura del patogeno.

Dopo il legame con il patogeno la DC muta il proprio assetto recettoriale, diventando sensibile alle chemochine di produzione linfonodale, e guidata da queste conduce il patogeno al linfonodo drenante più vicino.

Le DC mieloidi sono oggetto di ricerca per le terapie tumorali: si prelevano monociti in vivo, si differenziano in vitro in DC mature che vengono sensibilizzate con antigeni tumorali, e si reinoculano nel malato. La risposta è già efficace e in miglioramento, in particolare nel melanoma.

DC immature e mature: il cambio di mestiere

Perché contano quei due numeri: 7 milioni di molecole MHC-II significano poter esporre 7 milioni di peptidi diversi dello stesso antigene, e quindi attivare potenzialmente 7 milioni di specificità T diverse. L'aumento di emivita da 10 a 100 ore serve perché trovare, nel linfonodo, il linfocita T con il recettore giusto richiede tempo: il complesso MHC-peptide deve restare in superficie abbastanza a lungo.

Tutti i granulociti si differenziano nel midollo osseo. Sono polimorfonucleati (PMN), classificati in base all'affinità dei granuli per i coloranti.

Neutrofili

• Diametro 10–12 μm; 50–70% dei leucociti circolanti; produzione di 10¹¹ al giorno. Sono i più comuni granulociti del sangue periferico; nucleo polilobato.
• Riversati nel circolo dopo il differenziamento, vengono reclutati dalle citochine infiammatorie, effettuano diapedesi e nel tessuto svolgono attività microbicida. Se non vengono reclutati, vanno in apoptosi.
• Funzionalmente sono il braccio armato dei linfociti Th17 e proteggono soprattutto da funghi e batteri extracellulari.
• Muoiono dopo aver fagocitato: il pus in una ferita è costituito da neutrofili morti dopo la risposta infiammatoria.

Eosinofili

• PMN; secondo le sbobine meno dell'1% dei leucociti circolanti (0–450/μl). Granuli che si colorano con l'eosina.
• Fondamentali nelle risposte di tipo 2, innescate dai parassiti, compresi i macroparassiti pluricellulari (vermi), che sono troppo grandi per essere fagocitati.
• Portano il recettore per l'Fc delle IgE a bassa affinità: riconosciuto l'Fc di IgE legate a un parassita, degranulano liberando sostanze altamente tossiche che digeriscono il tegumento del parassita.
• Coinvolti anche in: broncospasmo, produzione di muco, aumento della chemiotassi, aumento della permeabilità endoteliale, e possibile azione autolesiva con danno tissutale.

Basofili

• PMN; meno dello 0,5% dei leucociti circolanti (0–200/μl); diametro ≈10 μm; nucleo bilobato.
• Esprimono il recettore per l'Fc delle IgE ad alta affinità (FcεRI). Le IgE si legano al recettore prima ancora di aver legato l'antigene: il basofilo resta così sensibilizzato.
• Quando l'antigene si presenta, il basofilo sensibilizzato degranula liberando istamina, eparina, perossidasi, idrolasi acide e altri mediatori dell'infiammazione. Se la sostanza è un allergene, questa è l'ipersensibilità di primo tipo (immediata).
• Il 30% della popolazione presenta IgE che sensibilizzano i basofili verso allergeni.
• Funzionalmente molto simili ai mastociti.

Mastociti

Cellule stanziali dei connettivi e delle mucose, in genere vicino alle venule del microcircolo. Due tipi:

• MMC — mastociti associati alle mucose;
• CTMC — mastociti associati ai tessuti connettivi.

Come i basofili esprimono il recettore ad alta affinità per l'Fc delle IgE, che restano legate alla membrana attraverso il frammento costante.

I mediatori neosintetizzati derivano dai fosfolipidi di membrana per azione della fosfolipasi A2, che libera acido arachidonico; da qui due vie:

Le natural killer sono le cellule linfoidi più rappresentate nell'immunità naturale e la principale componente linfoide dell'immunità innata (con le DC plasmacitoidi, anch'esse di stipite linfoide). Si sviluppano principalmente nel midollo osseo, ma anche nel timo, dal precursore comune linfoide indirizzato dal fattore di trascrizione ID2 — lo spartiacque fra linea T/B e compartimento innato.

Furono descritte per la prima volta come cellule capaci di lisare cellule tumorali; in seguito si vide che riconoscono anche cellule infettate da virus o da batteri a trofismo intracellulare.

• 5–15% delle cellule mononucleate del sangue periferico; presenti nella milza, molto meno nei linfonodi. Le ILC sono invece abbondanti nelle mucose.
• Leggermente più grandi di un linfocita T, citoplasma ricco di granuli contenenti perforina e granzimi; i granuli aumentano di numero con l'attivazione.
• Non esprimono recettori clonali: niente TCR, niente immunoglobulina di membrana, niente CD3. Esprimono invece CD56 e CD16.
• Oltre a uccidere, producono grandi quantità di IFN-γ, che attiva i macrofagi e li rende capaci di eliminare ciò che hanno fagocitato.

Le due sottopopolazioni, definite dall'intensità di CD56

La famiglia ILC

Negli ultimi anni le NK sono state inserite in un gruppo eterogeneo, le cellule linfoidi innate (ILC):

Le tre risposte, viste dal lato innato

Il meccanismo litico

Nel punto di contatto con il bersaglio si crea una vera e propria sinapsi; è al suo interno che la NK rilascia il contenuto dei granuli. Nelle immagini di microscopia i granuli di perforina, marcati in fluorescenza, si vedono tutti polarizzati verso il punto di contatto.

Il confinamento nella sinapsi non è un dettaglio: la perforina è un piccolo polipeptide che, ad alte concentrazioni di calcio, polimerizza in modo strutturato creando un poro. È un sistema estremamente efficace, e proprio per questo deve essere controllato — l'uccisione è precisa e diretta solo contro la cellula riconosciuta.

Perché uccidere per apoptosi e non per necrosi? Perché la morte del bersaglio non deve innescare infiammazione. Una cellula necrotica rilascia componenti riconosciuti dai TLR e dai recettori dell'innata (i DAMP), scatenando produzione di citochine infiammatorie. La cellula apoptotica viene invece riconosciuta e fagocitata da altre cellule dell'innata senza innescare alcuna infiammazione.

Missing self: come fa la NK a decidere

L'ipotesi del missing self prevede che la NK uccida tutte le cellule che non riconosce come proprie. Deve dunque esistere sulla membrana del bersaglio qualcosa che dia l'informazione "non uccidere": sono le molecole MHC di classe I, espresse su tutte le cellule nucleate, lette dai recettori inibitori della NK.

• Cellula che perde l'MHC-I (tipico delle cellule infettate e delle neoplastiche, che così sfuggono ai CTL) → nessuno stimolo sui recettori inibitori → lisi.
• Cellula con MHC-I normale → segnale inibitorio → nessuna degranulazione.

Il quadro reale è più complesso: la NK esprime anche recettori attivatori, e l'esito dipende dal bilanciamento fra i due segnali.

Il meccanismo molecolare del bilanciamento

• Recettori inibitori → coda citoplasmatica con sequenze ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) → reclutano fosfatasi → rimuovono gruppi fosfato → spengono la cascata.
• Recettori attivatori → sequenze ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activating motif) → associate a chinasi → fosforilazione → segnale verso il nucleo.

Se prevale l'inibitorio, la fosfatasi blocca l'attività chinasica dell'attivatore: nessuna uccisione. Le stesse sequenze ITIM/ITAM si ritroveranno su PD-1, CTLA-4, CD3, FcγRIIB: è un motivo ricorrente in tutta l'immunologia.

Le famiglie di recettori NK

MIC-A, MIC-B e ULBP: le molecole dello stress

Appartengono alla famiglia degli MHC di classe I ma sono non classiche: vengono espresse sulla membrana quando la cellula è in situazione di stress — infettata, danneggiata, trasformata. Normalmente sono confinate a livello citoplasmatico nelle cellule epiteliali ed endoteliali. Comparendo in superficie rendono la cellula visibile alla NK, che degranula. ULBP si associa in particolare alle cellule infettate da citomegalovirus, ed è in grado di legare alcune proteine virali.

Il ruolo strategico delle NK

Le NK coprono la finestra di due settimane in cui l'immunità specifica sta ancora espandendo i cloni. Sono specifiche, ma attraverso recettori non clonali. Quando l'espansione adattativa è pronta, i CTL uccidono le cellule infettate e i Th attivano l'innata con sistemi più fini.

ADCC: citotossicità NK mediata da anticorpi

La NK uccide un bersaglio opsonizzato da IgG grazie al CD16, recettore a bassa affinità per l'Fc delle IgG. È sfruttato clinicamente: un anticorpo terapeutico diretto contro una molecola espressa da una cellula neoplastica la rende automaticamente bersaglio delle NK.

Che altro può fare una cellula opsonizzata da IgG? Due cose:

• Fagocitosi mediata da anticorpo: neutrofili e macrofagi riconoscono l'Fc e mangiano la cellula opsonizzata.
• Attivazione del complemento: l'anticorpo legato tramite il Fab innesca C1q → cascata → complesso MAC sulla superficie → la cellula lisa (cap. 17).

I linfociti naive (vergini) sono cellule che non hanno mai incontrato l'antigene. Usciti dagli organi linfoidi primari ricircolano continuamente attraverso sistema linfatico, sangue e tutti gli organi linfoidi secondari.

Il processo di continua ricircolazione e perlustrazione si chiama traffico linfocitario e termina quando, in un organo linfoide secondario, il linfocita incontra il suo antigene specifico: questo evento è il priming.

• Nessun incontro → il linfocita esce dal linfonodo attraverso il vaso efferente e riprende il giro.
• Riconoscimento → espansione clonale e differenziazione in cellule effettrici, che abbandonano l'organo linfoide, passano per linfa, dotto toracico e vena cava, e via sangue raggiungono l'organo periferico dove è in corso l'infezione.

Esistono vie di homing diverse perché le varie sottopopolazioni linfocitarie devono localizzarsi nei microambienti tissutali in cui serve davvero una risposta.

Le componenti dell'immunità innata

L'immunità naturale, in ultima analisi, è un meccanismo di induzione di un processo infiammatorio.

PAMP

Pathogen-Associated Molecular Patterns: profili molecolari associati ai patogeni. Sono strutture molto conservate e ripetitive, condivise da intere classi di microbi, e sono conservate perché essenziali alla sopravvivenza del patogeno: se si modificassero, il microrganismo non sopravvivrebbe. Sono espressi solo dai microrganismi, non dalle nostre cellule — il che riduce moltissimo il rischio che l'innata attacchi il self.

Esempi riconosciuti:

• Acidi nucleici: RNA a singolo filamento di alcuni virus; RNA a doppio filamento; isole citosina-guanina (CpG) non metilate, caratteristiche di virus e batteri.
• Proteine: flagellina, componente dei flagelli batterici.
• Lipidi di parete: lipopolisaccaride (LPS), componente principale della parete dei Gram negativi e il più importante induttore dell'immunità innata; acido lipoteicoico.

DAMP

Danger/Damage-Associated Molecular Patterns, dette anche allarmine. Sono molecole nostre, rilasciate in condizioni di stress o di danno. Il criterio non è "estraneo/proprio" ma "dentro/fuori": molecole che normalmente stanno confinate dentro la cellula, trovate nell'ambiente extracellulare, segnalano che qualcosa è andato storto.

• Heat shock proteins.
• HMGB1: proteina strutturale non istonica della cromatina; confinata nel nucleo, se compare all'esterno segnala un danno non controllato.
• Cristalli: urato monosodico (gotta), calcio pirofosfato diidrato, asbesto, colesterolo, alluminio.
• ATP extracellulare, efflusso di K⁺, specie reattive dell'ossigeno.

Perché serve? Perché infiammazione è anche sinonimo di riparazione: l'organismo deve accorgersi del danno tissutale, non solo dell'infezione.

PRR: Pattern Recognition Receptors

Tutte le cellule dell'innata, e in particolare macrofagi, cellule dendritiche e neutrofili, esprimono una serie di recettori chiamati PRR. I loro geni sono in configurazione germinale: non cambiano, sono identici in tutte le cellule che li esprimono, a differenza dei recettori linfocitari che si formano per ricombinazione somatica. Distribuzione non clonale. Reattività al self parziale, proprio perché leggono anche i DAMP.

Classificazione strutturale — 5 famiglie

• TLR — Toll-like receptors
• CLR — C-type lectin receptors
• SR — Scavenger receptors
• NLR — NOD-like receptors (Nucleotide-binding Oligomerization Domain)
• RLR — RIG-like receptors (Retinoic acid Inducible Gene)

Classificazione funzionale

Classificazione per localizzazione

Struttura

Glicoproteine di membrana di tipo I, a singola catena polipeptidica, con tre domini:

• Dominio extracellulare (N-terminale), ricco di ripetizioni di leucina, deputato al riconoscimento del ligando. Nei TLR endosomiali questo dominio è intra-endosomiale: il dominio N-terminale che interagisce col ligando si affaccia sempre sul versante "esterno" — extracellulare o intra-endosomiale che sia.
• Dominio transmembranario, che ancora la proteina.
• Dominio citoplasmatico, responsabile della trasduzione. È identico a quello del recettore per l'interleuchina-1: per questo si chiama TIR (Toll/Interleukin-1 Receptor).

I dieci TLR umani

Ne sono stati descritti 13; i primi 10 anche nell'uomo, mentre per l'11, 12 e 13 i dati sono contrastanti (evidenziati nel modello murino, non univocamente nell'uomo).

Dove sono espressi: descritti la prima volta sulle cellule dendritiche, oggi si sa che sono espressi da buona parte delle cellule del sistema immunitario e non solo — monociti, polimorfonucleati, NK, cheratinociti, cellule epiteliali, linfociti B e linfociti T.

Perché i TLR sono decisivi per l'immunità specifica

I TLR sono importanti mediatori dell'infiammazione: inducono la produzione di molte citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IL-6, interferoni di tipo I) e delle molecole di co-stimolo.

Quest'ultimo punto è il ponte con l'immunità adattativa. Il linfocita T, per attivarsi, non basta che riconosca il peptide in MHC: occorre che la cellula presentante sia in stato di attivazione, definito dall'espressione delle molecole co-stimolatorie — espressione regolata proprio dai TLR.

Perché un sistema così elaborato? Perché le APC rielaborano continuamente anche proteine self. Il criterio evolutivo per distinguere proprio da non proprio è: la cellula si attiva solo quando sente la presenza di un patogeno.

La trasduzione: quattro proteine adattatrici

Tutti i TLR segnalano attraverso quattro proteine adattatrici citoplasmatiche, tutte caratterizzate dalla presenza di un dominio TIR, lo stesso che caratterizza la coda del TLR — è l'interazione TIR–TIR a permettere l'aggancio. In assenza di ligando questo non avviene; il riconoscimento del ligando causa una modificazione strutturale che rende il TIR del recettore reattivo verso il TIR dell'adattatore.

Le adattatrici sono: MyD88, TIRAP, TRIF, TRAM.

I fattori di trascrizione attivati a valle sono NF-κB, IRF-3, IRF-7.

Via MyD88-dipendente

Cascata:

Il punto chiave: finché NF-κB è legato a IκB non può traslocare. IκB è un inibitore; fosforilarlo significa liberare NF-κB. In assenza di MyD88 — e questo accade in alcune immunodeficienze — tutte le cellule che esprimono questi TLR non riescono ad attivarsi in risposta al ligando naturale.

Via MyD88-indipendente

Tempi

Dal riconoscimento del ligando alla trascrizione nel nucleo: 5–10 minuti. Dalla trascrizione alla produzione della citochina: 1–2 ore.

TLR e patologia: deficienze funzionali

Ad oggi sono state identificate almeno 7 mutazioni diverse a carico di geni che codificano proteine del signalling TLR, associate a EDA-ID o a HSE.

C-type lectin receptors (CLR)

Sono sia proteine transmembrana sia proteine solubili. Riconoscono carboidrati particolari, non presenti nel nostro organismo, in maniera Ca²⁺-dipendente.

• Di membrana → innescano fagocitosi nella cellula che li esprime.
• Solubili → opsonizzano il microbo, rendendolo più visibile ai fagociti.

Classificazione in tre tipi:

I tipi I e II riconoscono β-glucani, zimosani e prodotti virali: HIV-1, HCV, CMV, virus Ebola. La MBL è la proteina che innesca la via lectinica del complemento (cap. 17).

Scavenger receptors

Espressi sulla membrana, in particolare dai macrofagi della milza. Riconoscono strutture molecolari presenti sia su Gram negativi sia su Gram positivi. Nell'organismo hanno anche due funzioni "domestiche":

• Uptake delle lipoproteine acetilate o ossidate (es. LDL ossidate — il collegamento con l'aterosclerosi).
• Eliminazione delle cellule apoptotiche: la cellula in apoptosi modifica la propria membrana in modo da essere vista da questi recettori, che la eliminano senza innescare infiammazione.

La classificazione è ancora indietro rispetto agli altri PRR; alcuni testi riportano tre gruppi:

NOD-like receptors (NLR)

Recettori citoplasmatici, per molecole associate a patogeni e a stress cellulare. Struttura a tre domini:

• Dominio ricco in leucine (COOH-terminale) — riconosce il ligando, esattamente come nei TLR.
• Dominio NOD — oligomerizzazione.
• Dominio effettore (NH₂-terminale) — identifica tre sottofamiglie: CARD, PYD, BIR.

NLR della famiglia CARD (NOD1, NOD2)

Stesso principio dei TLR, ma il riconoscimento avviene nel citoplasma anziché all'esterno o nell'endosoma.

Oltre alla via NF-κB, NOD1 e NOD2 innescano la via delle MAPK, non ancora del tutto definita.

NLR della famiglia PYD — l'inflammasoma

Rispondono a PAMP e DAMP citoplasmatici formando complessi attivatori detti inflammasomi. Attivatori riportati: batteri patogeni, ATP extracellulare, efflusso di K⁺, specie reattive dell'ossigeno, cristalli (urato monosodico, calcio pirofosfato diidrato, asbesto, colesterolo, alluminio), DNA virale, muramil-dipeptide.

Patologie associate: sindromi autoinfiammatorie e gotta.

RIG-like receptors (RLR)

Famiglia di tre membri: RIG-I (retinoic acid-inducible gene I), MDA5 (melanoma differentiation-associated gene 5), LGP2 (laboratory of genetics and physiology). Espressi in tutte le cellule nucleate; riconoscono RNA a singolo e a doppio filamento.

• RIG-I e MDA5 sono elicasi con domini CARD, che attivano vie conducenti alla produzione di IFN di tipo I e altre citochine infiammatorie (via MAVS, mitochondrial anti-viral signaling protein).
• LGP2 manca del dominio CARD e funziona da regolatore di RIG-I e MDA5.

Le sette classi di idrolasi acide

Enzimi attivati dal pH acido dei lisosomi, ciascuno con un target specifico:

Insieme di proteine solubili e di membrana con ruolo importante nella difesa dell'ospite. Il nome viene dalla capacità di queste proteine di assistere, complementare l'attività antimicrobica degli anticorpi. Identificato da Jules Bordet nel 1898 come un gruppo di molecole del siero sensibili al calore, capaci di complementare gli effetti degli anticorpi nella lisi dei batteri.

• Oltre 30 proteine, per lo più sintetizzate dal fegato in modo costitutivo. C1, C2, C3 e C4 sono prodotte anche dai macrofagi, con produzione fortemente up-regolata da IL-6, TNF-α e IFN-γ.
• Sono zimogeni (proenzimi): presenti nel plasma in forma inattiva, si attivano per proteolisi sequenziali.
• La cascata produce una straordinaria amplificazione: poche molecole iniziali generano un numero elevatissimo di molecole effettrici.
• C3 è la proteina più abbondante del complemento nel plasma e ha ruolo cruciale in tutte e tre le vie: i bambini con deficit di C3 vanno incontro a infezioni batteriche devastanti.

Le tre vie di attivazione

Le tre vie differiscono per l'innesco e per il modo in cui arrivano alla C3 convertasi, ma da lì in poi le fasi tardive sono identiche.

Via classica

La componente coinvolta è C1 (chiamato così perché fu il primo scoperto), un complesso fatto di:

• C1q — la parte che lega l'anticorpo; struttura "a tulipano", i cui fiori sono le teste globulari;
• C1r e C1s — due proteasi, che eseguono i tagli.

C1q può legare la superficie del patogeno in tre modi

1. Direttamente — proteine della parete batterica o strutture polianioniche di superficie.
2. Attraverso la proteina C reattiva — che a sua volta lega residui di fosfocolina dei polisaccaridi batterici.
3. Attraverso gli anticorpi — IgG (dominio CH2, soprattutto IgG1 e IgG3) o IgM (dominio CH3) già legate all'antigene.

Quali anticorpi attivano la via classica

• IgG: le sottoclassi IgG1, IgG2, IgG3 (non IgG4). Servono almeno due IgG vicine sulla superficie, perché C1q possa legare due Fc contemporaneamente. Sono prodotte soprattutto nelle risposte secondarie.
• IgM: prodotte nelle risposte primarie, pentameriche. Avendo cinque unità hanno più Fc vicini e possono legare fino a 10 epitopi: basta una singola molecola di IgM per attivare il complemento.

Tappe

1. Le regioni Fc di anticorpi adiacenti diventano accessibili e legano C1.
2. C1q lega l'Fc; C1r e C1s si attivano.
3. Il C1 enzimaticamente attivo lega e taglia C4 e C2.
4. C4b si attacca covalentemente all'anticorpo e alla superficie del microbo (C4a viene rilasciato) e lega C2.
5. Si forma il complesso C4b2a = C3 convertasi della via classica, che taglia C3 in C3b (si fissa al microbo) e C3a.

Via lectinica

Mediata dalle lectine che legano il mannosio (MBL). Appartiene all'immunità innata, ma il meccanismo è molto simile alla via classica.

Le lectine sono proteine della fase acuta, prodotte dal fegato sotto l'effetto delle citochine pro-infiammatorie liberate dai macrofagi che hanno fagocitato i batteri. La citochina più importante in questo asse è l'interleuchina 6: raggiunge il fegato per via ematica e ne modifica il programma biosintetico, avviando la produzione di proteine della fase acuta, lectine e proteina C reattiva — tutte con la funzione di attivare il complemento e indurre fagocitosi.

Struttura: un'α-elica con due braccia, alle cui estremità stanno le teste, i domini che legano il mannosio. Funzionano come ventose: si attaccano al mannosio e al fucosio della parete batterica, disposti a distanze ben precise. Negli eucarioti questi carboidrati sono disposti diversamente e la lectina non si lega: è così che il sistema distingue il self dal non-self.

MASP = Mannose-Associated Serine Protease: serin-proteasi legate alla lectina, che si attivano al legame e tagliano C4 e C2 esattamente come farebbero C1r/C1s.

Via alternativa

È il microrganismo stesso ad attivare il complemento.

Nel plasma il C3 circola in forma inattiva e possiede un legame tioestere intramolecolare che può subire idrolisi spontanea. Se questa idrolisi avviene vicino alla superficie di un microbo, C3b si attacca covalentemente alla superficie (C3a resta solubile) e la cascata parte.

1. C3b si deposita sulla superficie microbica, formando legami covalenti con proteine o polisaccaridi del microbo.
2. Il fattore B si lega a C3b.
3. Il fattore D (una proteasi plasmatica) taglia il fattore B: Ba si stacca, Bb resta legato.
4. C3bBb = C3 convertasi della via alternativa, che taglia altre molecole di C3.
5. Si genera un ciclo di amplificazione rapidissimo: la superficie del microbo si ricopre di C3b e di nuove C3 convertasi.

Esistono comunque meccanismi di protezione: molti C3b possono essere degradati da proteine serin-proteasiche (vedi regolazione, sotto).

Fasi finali: il complesso di attacco alla membrana

Il C3b, oltre che alla superficie batterica, può legarsi alla C3 convertasi stessa: quando lo fa si forma la C5 convertasi, che taglia C5 generando C5b. C5b è molto instabile e viene stabilizzato legando in sequenza C6, C7, C8: si forma il complesso MAC (membrane attack complex), già in grado di lisare per esempio gli eritrociti, ma non le cellule batteriche. Solo con l'aggiunta di C9, che polimerizza formando il poro vero e proprio, il MAC raggiunge la versione definitiva capace di lisare qualsiasi cellula. Attraverso il poro entrano acqua e ioni: il microbo muore. Il poli-C9 è la componente principale del MAC e la sua formazione è il risultato finale dell'attivazione del complemento.

Regolazione

Una cascata così potente e così amplificata deve essere tenuta sotto controllo e attivarsi solo quando serve. La regolazione è affidata a proteine espresse dalle cellule dell'ospite (in forma secreta o di membrana) e assenti sulla parete dei batteri — è questo il criterio che protegge i nostri tessuti.

I deficit congeniti dei regolatori causano attivazione incontrollata e patologica: edema angioneurotico ereditario (deficit di C1 INH) ed emoglobinuria parossistica notturna.

Recettori per le frazioni del complemento

Le funzioni del complemento

Patologia: i deficit congeniti

Le citochine sono proteine solubili coinvolte nelle reazioni immunitarie e infiammatorie, responsabili della comunicazione fra leucociti e fra leucociti e altri tipi cellulari. Sono molecole di segnale, e giocano un ruolo anche su cellule non immunitarie.

• Ogni citochina ha un proprio recettore, attraverso il quale innesca una cascata intracellulare.
• Pleiotropia: la stessa citochina può avere funzioni diverse.
• Ridondanza: la stessa funzione può essere svolta da più citochine.
• La secrezione da parte di macrofagi e DC è fortemente stimolata dal legame di componenti batteriche o virali ai TLR.

Raggio d'azione

Classificazione funzionale

• Fattori di crescita e differenziazione
• Citochine pro-infiammatorie
• Citochine anti-infiammatorie o regolatorie
• Citochine chemotattiche = chemochine

Le principali citochine dell'innata

Le sbobine elencano inoltre: linfotossine (LTα, LTβ), interferoni (IFN-α, β, γ), famiglia IL-12 (IL-12, IL-23, IL-27, IL-35), IL-15, famiglia IL-17 (IL-17A–F), IL-18.

TNF, IL-1 e le chemochine sono le principali citochine del reclutamento di neutrofili e monociti al sito d'infezione. Insieme a IL-6 stimolano il fegato a produrre proteina C reattiva e fibrinogeno. Infezioni gravi e diffuse possono causare lo shock settico: ipotensione, coagulazione intravascolare disseminata (CID), disturbi metabolici.

Classificazione temporale

Farmaci biologici anti-citochina

Come si neutralizza selettivamente una citochina? Serve qualcosa che abbia come bersaglio una proteina e una sola: un anticorpo con quella specificità, inoculato nel paziente. Usati con effetti importanti in morbo di Crohn, artrite reumatoide e molte altre patologie.

Proteine della fase acuta

Proteine la cui sintesi è indotta da IL-1, IL-6 e TNF-α. Compaiono nei primi momenti dell'attivazione dell'innata, prodotte in qualche ora, soprattutto dal fegato, che cambia il proprio programma biosintetico. Alcune sono particolarmente interessanti perché mimano l'azione degli anticorpi, ma con ampia specificità per i PAMP anziché per un singolo epitopo.

Chemochine

Polipeptidi di 6–14 kDa ad attività chemotattica, caratterizzati da due ponti disolfuro interni. Ne sono state descritte oltre 50. La classificazione si basa sulla posizione delle cisteine N-terminali:

Funzioni

• Regolano il traffico dei linfociti attraverso gli organi linfoidi.
• Reclutano le cellule del sistema immunitario nei focolai d'infezione.
• Numerose altre funzioni biologiche: sviluppo di molti organi, stimolo o inibizione della proliferazione cellulare.

Il reclutamento leucocitario, passo per passo

Le citochine cambiano l'espressione delle molecole di adesione sull'endotelio. In un primo momento gli agganci sono deboli e il neutrofilo rotola sulla superficie endoteliale, finché le chemochine più affini lo fermano. I granulociti attraversano poi gli spazi fra le cellule endoteliali (diapedesi) e, muovendosi secondo gradiente chemotattico, arrivano nel focolaio a fagocitare il microrganismo.

Le sei caratteristiche della risposta specifica

Delle sei, le prime quattro (specificità, diversificazione, non reattività al self, specializzazione) sono acquisite dal linfocita durante la maturazione — nel timo per il T, nel midollo osseo per il B. Memoria e autolimitazione si realizzano invece in periferia, dopo l'incontro con l'antigene.

Le fasi della risposta immunitaria specifica

La teoria della selezione clonale

Le strutture antigeniche possibili sono oltre 10⁹. Ogni linfocita B o T riconosce una e una sola struttura antigenica. Come fanno allora i linfociti a riconoscerne così tante?

1. Durante la maturazione negli organi linfoidi primari, ogni linfocita costruisce un recettore capace di legare in modo specifico un singolo antigene. Questa fase avviene in assenza dell'antigene.
2. Le cellule vergini entrano in circolo e perlustrano l'organismo.
3. Un antigene entra in contatto con il sistema immunitario e viene riconosciuto solo dai linfociti dotati del recettore specifico, negli organi linfoidi secondari.
4. Solo quelle cellule proliferano, dando espansione clonale, e producono anticorpi o cellule effettrici.

La formula da ricordare: è l'antigene che sceglie il proprio linfocita, non il linfocita che si adatta all'antigene.

Chi fa che cosa: i tre bracci

Le due immunità sono trasferibili da un donatore immunizzato a un ricevente compatibile non immunizzato: l'umorale tramite l'inoculo di siero, la cellulo-mediata tramite globuli bianchi vitali, in particolare linfociti T.

Per dare un'idea dei numeri in gioco: nell'organismo circolano circa 370 miliardi di cellule T, di cui 7 miliardi nel torrente circolatorio.

Le famiglie di linfociti si distinguono per i marcatori di superficie, riconosciuti da anticorpi monoclonali. Si chiamano CD (Cluster di Differenziazione) seguiti da un numero, e indicano lo stato differenziativo o maturativo della cellula.

La tecnica che li sfrutta è la citofluorimetria a flusso (FACS): si usano anticorpi specifici per i CD coniugati a molecole fluorescenti diverse e si analizza cellula per cellula. Con anti-CD4 e anti-CD8 marcati in fluorescenze diverse si distinguono e si contano le due sottopopolazioni T in un paziente.

Valori normali delle cellule del sangue

Le sottopopolazioni, in tabella

Note sulle singole voci:

• Il CD3 è la molecola associata al TCR che trasduce il segnale del recettore: è il marcatore comune a tutti i linfociti T.
• Il CD25 dei T regolatori è la catena α del recettore per l'interleuchina 2, fattore di crescita dei linfociti T.
• I T regolatori, pur essendo CD4 e quindi formalmente helper, inibiscono le risposte immunitarie tramite citochine. Sono cruciali nelle fasi finali della risposta e nel mantenimento della tolleranza al self.
• Le NKT sono a cavallo fra innata e specifica: hanno TCR αβ ma a specificità limitata, riconoscono lipidi e complessi glicolipidici presentati dal CD1, sono citotossiche, e sopprimono o attivano sia le risposte innate sia quelle adattative.
• Le NK erano chiamate in passato "grandi linfociti granulari".

La scoperta: dove stanno gli anticorpi

Gli anticorpi vengono chiamati gammaglobuline perché nel 1939 Tiselius e Kabat dimostrarono che si trovano nella frazione γ delle globuline sieriche. L'esperimento:

1. Immunizzarono conigli con ovalbumina; dopo ~10 giorni prelevarono il siero, ricco di anticorpi anti-ovalbumina (antisiero).
2. Corsa elettroforetica dell'antisiero: le proteine si separano per massa e carica. Compaiono il picco dell'albumina e i tre picchi delle globuline α, β e γ; quest'ultimo particolarmente elevato.
3. Trattarono il siero con ovalbumina: gli anticorpi la legarono e precipitarono.
4. Dopo centrifugazione, nuova corsa elettroforetica: il picco delle gammaglobuline era scomparso.

Prima dimostrazione che gli anticorpi sono proteine del siero, e che nella maggior parte dei casi migrano nel picco γ.

Struttura di base

Glicoproteine a forma di Y: due braccia e una parte che le sorregge. Sono costituite da:

• Due catene pesanti (H), grandi;
• Due catene leggere (L), molto più piccole;
• Ogni catena leggera è legata a una pesante da un ponte disolfuro; anche le due catene pesanti sono unite fra loro da ponti disolfuro.

Le catene leggere sono di due soli tipi, κ o λ: un anticorpo monta due κ oppure due λ, mai una di ciascuna. Le catene pesanti sono invece di cinque tipi — gli isotipi, che danno il nome alle cinque classi:

Regioni variabili e costanti

• All'estremità amminica di entrambe le catene — verso le braccia — stanno le regioni variabili, che cambiano da anticorpo ad anticorpo: sono quelle che prendono contatto con l'antigene.
• La catena leggera ha 1 dominio variabile + 1 dominio costante.
• La catena pesante ha 1 dominio variabile + 3 o 4 domini costanti, secondo la classe; i domini costanti non cambiano all'interno della stessa classe.

Il dominio immunoglobulinico

Regioni di 110 amminoacidi, conservate nell'evoluzione, probabilmente derivate dalla duplicazione di un gene ancestrale. Struttura: foglietti β antiparalleli disposti a formare due foglietti planari uniti da un ponte disolfuro, con caratteristica forma ovoidale. I foglietti sono connessi da nastri (loop) che mantengono la struttura e che vanno a costituire le regioni di contatto con l'antigene.

Questo dominio definisce la superfamiglia delle immunoglobuline, cui appartengono, oltre agli anticorpi: TCR, molecole MHC, CD4, CD8, CD3, CD19, CD21, Igα/Igβ, ICAM, i recettori Fc, i KIR — praticamente tutto il repertorio molecolare dell'immunologia.

Le CDR

Nella regione variabile i nastri costituiscono le CDR (complementarity determining regions), dette anche zone ipervariabili. Sono tre per catena (CDR1, CDR2, CDR3) ed è lì che si concentra la maggior parte delle differenze di sequenza fra anticorpi diversi: sono le CDR a determinare la specificità. Il diagramma di Kabat-Wu lo dimostra graficamente, mostrando i tre picchi di variabilità lungo la sequenza.

L'immagine usata a lezione: le due regioni variabili (pesante e leggera) come due mani, le cui dita — le zone ipervariabili — accolgono l'antigene e formano con esso legami deboli.

Zona cerniera

Presente fra il primo e il secondo dominio costante della catena pesante nelle classi γ, δ, α; assente in μ ed ε. È una zona ricca di amminoacidi che consente il movimento delle braccia, che possono allargarsi e stringersi. Serve: se su una superficie microbica ci sono determinanti antigenici distanti fra loro, un anticorpo che può allargare le braccia ha più probabilità di legarli entrambi, e il legame risulta più forte. È un'importante evoluzione strutturale, che aumenta la flessibilità.

Gli esperimenti di Porter (1962): a cosa serve ogni pezzo

Forma di membrana e forma secreta

Le immunoglobuline funzionano sia da recettore (BCR) sia da molecola effettrice (anticorpo secreto). Le si trova: sulla membrana dei linfociti B; nel RE e nel Golgi dei B, dove vengono costruite; nel plasma e nel siero; nelle secrezioni mucose — saliva, lacrime, dove prevalgono le IgA; in piccola quantità nel fluido interstiziale.

La differenziazione fra le due forme avviene durante la traduzione, per splicing alternativo del trascritto della catena pesante:

• Se alla porzione C-terminale viene aggiunto il peptide M, idrofobico → l'anticorpo resta ancorato alla membrana: è un BCR.
• Se viene aggiunto il peptide S, idrofilico → l'anticorpo è secreto.

La scelta dipende da quale sito di poliadenilazione viene attivato a valle dell'esone C4. Lo stesso meccanismo (splicing alternativo) spiega perché il linfocita B vergine possa esprimere contemporaneamente IgM e IgD con la stessa specificità.

L'immunoglobulina di membrana lega l'antigene con la parte variabile, ma non è in grado di trasdurre il segnale: per questo al BCR è sempre associato il complesso Igα/Igβ — due proteine unite da ponti disolfuro, con domini immunoglobulinici e, nella porzione intracitoplasmatica, motivi ITAM che vengono fosforilati per trasmettere il segnale.

Le cinque classi in dettaglio

Gli anticorpi secreti possono essere monomerici (una unità a Y) o polimerici, tenuti insieme dalla catena J (joining).

Le funzioni effettrici, in sintesi

Anticipate qui in elenco e sviluppate nel capitolo 33:

• Neutralizzare microbi, tossine o prodotti tossici.
• Attivare il complemento.
• Opsonizzare — rivestire il patogeno e prepararlo alla fagocitosi: un antigene opsonizzato è fagocitato molto più rapidamente.
• Indurre la citotossicità cellulo-mediata attraverso le NK, dotate del recettore per le IgG legate alla superficie delle cellule infettate.

Affinità

Forza di legame fra un singolo sito di combinazione dell'anticorpo e un singolo determinante antigenico. Operativamente: la concentrazione molare di antigene necessaria perché il 50% dei siti di combinazione sia occupato.

• Si esprime come costante di affinità Ka o, inversamente, come costante di dissociazione Kd (Kd = 1/Ka).
• Valori tipici: Kd 10⁻⁷–10⁻¹⁰ M nel primo contatto; fino a ≈10⁻¹¹ M negli anticorpi maturi.
• Più alta è l'affinità, minore è la concentrazione di antigene necessaria per formare il complesso.
• L'affinità aumenta nelle risposte anamnestiche: gli anticorpi secondari legano l'antigene anche a concentrazioni molto basse.
• Cinetica: on-rate molto rapido, off-rate variabile — ed è l'off-rate a fare la differenza fra un anticorpo affine e uno no.

Valenza e avidità

La valenza è il numero di epitopi identici che l'anticorpo può legare contemporaneamente.

L'avidità è la forza complessiva del legame e dipende dalla valenza effettivamente realizzata:

• Epitopi distanti → l'anticorpo lega con un solo braccio → valenza 1 → avidità bassissima, il legame non si mantiene.
• Epitopi vicini → interazione bivalente → avidità alta.

Titolo anticorpale

L'inverso della più bassa concentrazione (cioè della più alta diluizione) del siero del paziente che mantiene attività rilevabile verso un antigene noto.

Nell'esempio della lezione, l'ultima diluizione in cui l'attività è ancora visibile è 1:128: il titolo è 128.

Le tre modificazioni della struttura anticorpale durante la risposta

I due meccanismi molecolari sono descritti nel capitolo 26; il contesto cellulare in cui avvengono nel capitolo 32.

I recettori per l'antigene dell'immunità specifica sono due, e sono profondamente diversi:

Il TCR è "più povero" del BCR quanto a versatilità di riconoscimento: è evidente che il BCR sia molto più capace del TCR di riconoscere antigeni. Il TCR compra però qualcosa in cambio: la capacità di vedere ciò che succede dentro le cellule, che il BCR non ha.

Struttura delle catene

Tutte e quattro le catene (α, β, γ, δ) hanno la stessa architettura:

• Regione variabile, codificata dalla giunzione dei segmenti genici;
• Regione costante, specifica per ciascuna catena;
• Dominio transmembrana, che ancora la catena;
• Coda citoplasmatica carbossi-terminale, incapace di segnalare verso il nucleo: si associa a molecole adattatrici.

Il complesso CD3

Le molecole del CD3 sono le strutture deputate alla trasmissione del segnale, associate al TCR. Portano domini ITAM, che trasducono il segnale di attivazione dalla membrana verso il nucleo. Fra le catene adattatrici c'è anche la catena ζ, la stessa che serve al CD16 delle NK.

Il problema che doveva essere risolto

Gli immunologi si sono trovati davanti a tre problemi:

1. L'esistenza, nello stesso anticorpo, di domini variabili e domini costanti.
2. La diversità enorme del sito combinatorio: il repertorio è di almeno 10¹¹ recettori diversi. Il Progetto Genoma Umano ha stimato 20.000–25.000 geni codificanti proteine: non bastano.
3. L'esistenza dei cinque isotipi, con la possibilità di cambiare classe mantenendo la specificità.

Due teorie a confronto:

La sintesi emersa dagli studi: ogni regione variabile è generata dal riarrangiamento di un numero relativamente modesto di segmenti genici ereditati, che si ricombinano in modo casuale; la regione si diversifica poi ulteriormente per ipermutazione somatica quando la cellula incontra l'antigene.

L'esperimento di Tonegawa (1976, Nobel 1987)

1. Modello: cellule di mieloma/plasmacitoma (tumori di plasmacellule che producono anticorpi) confrontate con cellule somatiche o embrionali che non producono anticorpi.
2. DNA estratto e trattato con enzimi di restrizione; frammenti separati per elettroforesi.
3. Ibridazione con una sonda: l'mRNA della catena leggera marcato con fosforo radioattivo.
4. Risultato: nelle cellule di mieloma la sonda si legava a una sola banda; nelle cellule embrionali a due bande.

Conclusione: nelle cellule embrionali i geni della regione variabile e della regione costante si trovano lontani sul DNA; durante lo sviluppo dei linfociti B vengono avvicinati e il DNA interposto viene eliminato. Prima dimostrazione che segmenti di DNA genomico sono riarrangiati nella linea dei linfociti B e non in altre cellule.

L'organizzazione multigenica

La regione variabile di 110 amminoacidi è costituita da tre tipi di segmenti:

• V — variable
• D — diversity, presenti solo nelle catene pesanti (Ig) e nelle catene β e δ (TCR)
• J — joining

Loci delle immunoglobuline

Ogni segmento del dominio costante è a sua volta costituito da 5 o 6 esoni: 3 o 4 codificano i domini costanti della catena pesante, mentre 2 o 3 esoni minori codificano — se necessario — la parte carbossiterminale della forma di membrana e la coda intracitoplasmatica. Se l'anticorpo dovrà essere un BCR, vengono trascritti anche questi due esoni.

Loci del TCR

Il meccanismo: RAG e le sequenze segnale

Gli enzimi sono le ricombinasi V(D)J, RAG-1 e RAG-2, coordinate con enzimi di riparazione del DNA. RAG individua gli esoni da unire, li taglia; gli enzimi di riparazione richiudono. Questo processo avviene solo nei linfociti B e T.

RAG riconosce le RSS (recombination signal sequences): sequenze palindromiche conservate di 7 nucleotidi (eptamero) e 9 nucleotidi (nonamero), separate da uno spaziatore non conservato di 12 o 23 paia di basi.

La regola 12/23

Un segmento genico può ricombinare con un altro solo se uno è fiancheggiato da una RSS-12 e l'altro da una RSS-23. Solo così la coppia viene riconosciuta dal complesso RAG.

Perché la regola esiste, con l'esempio della catena pesante: gli esoni V hanno spaziatore 23 e anche gli esoni J hanno spaziatore 23. Una ricombinazione diretta V-J è quindi impossibile. I segmenti D hanno invece spaziatori di 12 sia a 5' sia a 3': è necessario che la prima ricombinazione sia D-J e la seconda V-DJ. La regola 12/23 impone l'ordine del riarrangiamento e impedisce giunzioni inutili.

Delezione e inversione

Le tappe molecolari

1. Sinapsi — i segmenti V e J (o D e J) vengono avvicinati attraverso le sequenze di riconoscimento.
2. Taglio — RAG-1 e RAG-2 tagliano alla base fra gli esoni; le RSS e il DNA interposto vengono eliminati. Le estremità degli esoni non vengono tagliate in modo netto: formano una struttura a forcina, l'hairpin.
3. Apertura dell'hairpin — a opera dell'enzima Artemis.
4. Processazione e ligazione — intervengono le DNA-PK e la TdT (deossinucleotidil-transferasi terminale), che aggiungono nucleotidi.

Patologie del riarrangiamento

Le fonti di diversità

La diversità giunzionale nel dettaglio

• Aggiunta di nucleotidi:
  • Nucleotidi P (palindromici), copiati da uno stampo: quando Artemis taglia la forcina in modo asimmetrico, il DNA si apre lasciando filamenti singoli più lunghi; enzimi aggiungono nucleotidi seguendo lo stampo del filamento più lungo.
  • Nucleotidi N, non codificati da stampo: quando i due filamenti sono pari, interviene la TdT che aggiunge nucleotidi casuali. È il maggior contributo alla diversità.
• Rimozione di nucleotidi per elisione da parte di nucleasi: a seconda di quale parte viene eliminata si codifica un amminoacido diverso.

Poiché queste aggiunte e rimozioni non rispettano il modulo di 3, può capitare che la sequenza non sia più traducibile: il riarrangiamento è allora improduttivo e va ripetuto sull'altro allele.

I numeri

Confronto fra linfociti B e T

Le tre funzioni del timo

1. Generazione del repertorio clonale T — espressione del TCR, sia αβ sia γδ.
2. Induzione dell'espressione dei co-recettori CD4 e CD8 — generazione delle due grandi sottopopolazioni.
3. Selezione dei cloni T efficaci ma non autolesivi — selezione positiva e negativa, cioè la tolleranza centrale.

Anatomia funzionale e chemochine

Il lobulo timico ha una zona corticale (subcapsulare) e una zona midollare; al confine sta la giunzione cortico-midollare, sede in cui arrivano i precursori linfoidi provenienti dal midollo osseo.

Il precursore che arriva non è ancora deciso

Il precursore linfoide che raggiunge il timo non è ancora indirizzato in modo definitivo verso T CD4/CD8: stimolato con opportuni fattori di crescita può ancora differenziare in cellula dendritica mieloide, monocita o cellula dendritica linfoide. È privo delle molecole tipiche del linfocita T (CD3ε, CD2, CD7).

La prova sperimentale: topo scid e topo nude

Due modelli murini, entrambi privi di linfociti T periferici, ma per ragioni opposte:

I due esperimenti incrociati:

• Trapiantando un timo di topo scid in un topo nude: le staminali del nude ripopolano quel timo e in poche settimane compaiono linfociti T periferici.
• Trapiantando staminali midollari di topo nude in un topo scid: le cellule del nude popolano il timo dello scid e in poche settimane si hanno T maturi in periferia.

Conclusione: la maturazione T richiede sia un precursore competente sia uno stroma timico funzionante. È la dimostrazione del ruolo indispensabile dello stroma.

Le fasi della maturazione

La distinzione fondamentale è fra una fase antigene-indipendente (il TCR non è ancora espresso) e una fase antigene-dipendente, che a sua volta si divide in due: nel timo, dove l'antigene è autologo, e negli organi linfoidi secondari, dove l'antigene è estraneo.

Il numero di precursori che raggiunge il timo è piccolissimo, e le selezioni ne uccideranno la maggior parte: sono quindi necessarie due ondate proliferative.

Le quattro funzioni del pre-TCR

1. Esclusione allelica — blocca il riarrangiamento del locus β sul secondo allele.
2. Innesca la seconda ondata proliferativa del pre-linfocita.
3. A valle di questa, induce l'espressione contemporanea dei co-recettori CD4 e CD8 (fase doppio positiva).
4. Stimola la ricombinazione della catena α, che completa il TCR maturo.

Come il TCR, anche il pre-TCR non trasduce autonomamente: si appoggia alle molecole del complesso CD3.

Selezione positiva e selezione negativa

Insieme, le due selezioni costituiscono la tolleranza centrale dei linfociti T.

Come si decide fra CD4 e CD8: la teoria istruttiva

I due co-recettori sono indotti dal segnale del pre-TCR e in una fase sono co-espressi. La cellula mantiene poi l'uno o l'altro in base a quale MHC il suo TCR è in grado di riconoscere:

La prova sperimentale: il topo mutante negativo per MHC di classe II. Le sue cellule timiche non esprimono MHC-II, quindi nessun timocita può essere testato per la capacità di riconoscerlo. Risultato: in quel topo maturano solo linfociti T CD8. La teoria istruttiva è così dimostrata in modo inequivocabile.

Struttura dei co-recettori

La citofluorimetria del timo

Analizzando i timociti umani si osservano:

• La popolazione più rappresentata: CD4⁺CD8⁺ (doppio positiva). Metà di queste esprime già il TCR αβ (loci α e β entrambi ricombinati), metà esprime ancora il pre-TCR.
• CD4⁺CD8⁻ TCRαβ⁺: T helper maturi pronti per la periferia.
• CD4⁻CD8⁺ TCRαβ⁺: T citotossici maturi pronti per la periferia.
• Una piccola frazione doppio negativa: gli stadi più precoci, i γδ e le NKT.

αβ o γδ? Il modello istruttivo

La prima catena TCR riarrangiata è la β, ma contemporaneamente vengono ricombinate anche γ e δ: c'è un momento in cui la cellula ha ricombinato tutte e tre. Come sceglie? Due modelli, entrambi "istruttivi":

Perché la maggior parte dei T è αβ: per il TCR γδ servono due eventi ricombinatori (catena γ e catena δ); per il pre-TCR ne basta uno (la catena β, poi associata alla pre-α già disponibile). Il pre-TCR arriva quindi in membrana prima e più spesso.

Tutta la maturazione dei linfociti B avviene nel midollo osseo, a differenza dei T che in fase di pro-linfocita migrano nel timo. Le tappe sono in gran parte sovrapponibili.

Le tappe

In sintesi: proliferazione → espressione del recettore → selezione di un recettore utile e non dannoso.

Ordine e regolazione dei riarrangiamenti

Il sistema procede allele per allele, catena per catena, e si ferma appena ottiene un risultato utile:

1. V-D-J della catena pesante sul primo allele (stadio pro-B). Utile → si prosegue. Non utile → riarrangiamento del secondo allele. Non utile neanche quello → apoptosi.
2. Catena pesante espressa in superficie con la catena leggera surrogata (stadio pre-B). Questa espressione inibisce ogni ulteriore riarrangiamento della catena pesante → esclusione allelica.
3. Il pre-BCR stimola il riarrangiamento della catena leggera. Ordine rigido: V-J di κ sul primo allele → κ sul secondo allele → λ sul primo allele → λ sul secondo allele.
4. Ottenuto un riarrangiamento utile, catena pesante e leggera si associano: il recettore completo inibisce il riarrangiamento delle altre catene leggere → esclusione isotipica.

Selezione dei linfociti B e editing recettoriale

Nel midollo, la selezione primaria:

• Riconoscimento debole degli antigeni self → la cellula prosegue la maturazione (selezione positiva).
• Riconoscimento forte degli antigeni self → la cellula è pericolosa e va eliminata per morte programmata (selezione negativa).

Prima di essere eliminati, però, i linfociti B fortemente autoreattivi hanno una seconda possibilità: l'editing recettoriale. Invece di andare subito in apoptosi, la cellula riarrangia di nuovo la catena leggera. Se il nuovo recettore non riconosce più il self, la maturazione continua; se è ancora fortemente autoreattivo, la cellula muore.

Ipermutazione somatica

Avviene negli organi linfoidi secondari (linfonodi, milza), esattamente nei centri germinativi, quando i linfociti B hanno riconosciuto l'antigene e cominciano la fase di maturazione. È la base dell'aumento dell'affinità: più volte un soggetto incontra lo stesso antigene, più i recettori B che si generano sono affini.

Condizioni necessarie

• L'antigene deve essere di tipo proteico, cioè timo-dipendente.
• Devono intervenire i linfociti T CD4 helper, che per attivarsi devono riconoscere via TCR peptidi linearizzati dell'antigene associati a MHC-II.
• Deve realizzarsi il legame CD40 – CD40L fra linfocita B e linfocita T.

Dove e come

• Nelle regioni variabili di catena pesante e catena leggera, precisamente nelle CDR. Nella catena pesante è la CDR3 ad accumulare più mutazioni puntiformi nel tempo.
• Le mutazioni aumentano col passare dei giorni dal contatto con l'antigene, con incremento esponenziale nelle risposte secondarie e terziarie (misurate come mutazioni per 1000 paia di basi).
• Enzima responsabile: la citidina deaminasi indotta dall'attivazione (AID). Una sua alterazione o mancanza blocca l'accumulo di mutazioni: senza AID non si può avere maturazione dell'affinità.

Ogni mutazione va poi verificata: solo i recettori diventati più affini vengono ulteriormente espansi (cap. 32).

Scambio isotipico (commutazione di classe)

Durante le risposte ripetute allo stesso antigene, l'anticorpo mantiene la specificità ma può cambiare classe, perché viene scelta la classe più idonea a eliminare quel patogeno.

La struttura genomica lo consente: a valle del riarrangiamento VDJ e a monte di ciascun gene della catena pesante si trovano le regioni S (switch), o regioni di scambio.

Condizioni: lo scambio isotipico avviene solo se intervengono i linfociti Th, le loro citochine e il ligando CD40.

Il meccanismo molecolare

1. La citochina (per esempio IL-4) attiva le regioni S coinvolte: prima Sμ, poi la regione S del gene bersaglio.
2. Le due regioni S vengono aperte e trascritte in un trascritto di RNA.
3. AID sostituisce citosina con uracile su un filamento, in entrambe le regioni.
4. L'uracil-N-glicosilasi (UNG) rimuove l'uracile.
5. L'endonucleasi APE1 taglia il filamento privato dei nucleotidi, e taglia anche la porzione accoppiata con l'RNA.
6. Il DNA compreso fra i due tagli viene eliminato ad ansa: VDJ si ritrova giustapposto alla nuova catena costante. Si ha la giunzione di due regioni di scambio.

Quale citochina dà quale classe

I tipi di linfocita B

L'MHC è un locus genico in cui mappano molti geni che codificano le molecole capaci di presentare peptidi antigenici ai linfociti T — e anche geni che servono alla processazione stessa dell'antigene.

Nell'uomo le molecole MHC si chiamano anche HLA (Human Leukocyte Antigens), perché furono identificate per via sierologica: usando anticorpi presenti nel plasma di soggetti pluritrasfusi o di donne pluripare, capaci di riconoscere i leucociti di un donatore. È così che nacque la tipizzazione, il procedimento immunologico per determinare gli antigeni delle cellule del sangue e dei tessuti, oggi eseguito con metodiche molecolari: serve a stabilire se un organo può essere usato per un trapianto, cercando la massima compatibilità e riducendo il rigetto.

Come è stato scoperto

Anni '40–'50, esperimenti sui topi singenici. Accoppiando fratello-sorella per molte generazioni si ottengono ceppi praticamente omozigoti per tutti i geni, tranne che per l'MHC.

• Trapianto di cute all'interno dello stesso ceppo (stesse molecole MHC) → nessun rigetto.
• Trapianto di cute da un topo di tipo a a un topo di tipo b → rigetto.

Emerse così il concetto di geni di istocompatibilità, ereditati, che determinano il rigetto. Restava però un problema: sembrava impossibile che la natura avesse selezionato geni per controllare i trapianti, che non sono un evento fisiologico.

Anni '60–'70, Benacerraf e McDevitt. Immunizzando con lo stesso antigene proteico topi che differivano solo per l'MHC, si osservò che alcuni davano una forte risposta anticorpale e altri non producevano affatto anticorpi. Le molecole MHC controllano dunque la risposta anticorpale verso determinati antigeni — e si vide poi che lo fanno attraverso la diversa capacità di attivare i linfociti T helper. Il ruolo dell'MHC è quindi attivare le risposte immunitarie mediate dai linfociti: il rigetto è un effetto collaterale.

Il sistema è importante non solo nei trapianti, ma anche nella predisposizione a malattie autoimmuni.

Restrizione MHC: Zinkernagel e Doherty (1974, Nobel 1996)

1. Un topo di ceppo A viene infettato con il virus della coriomeningite linfocitaria.
2. Dopo 7–10 giorni si preleva il sangue, che contiene cloni di CTL antigene-specifici per quel virus.
3. Questi CTL vengono co-coltivati con cellule bersaglio infettate del ceppo A, e poi con cellule bersaglio infettate del ceppo B.
4. Risultato: i CTL uccidono solo i bersagli del ceppo A. Le cellule del ceppo B, pur infettate dallo stesso virus, non vengono toccate.

Conclusione: i linfociti T fanno un doppio riconoscimento, del peptide antigenico e delle molecole MHC self. Per questo si dice che i linfociti T sono MHC-ristretti.

Le regole di attivazione dei linfociti T

I linfociti T non si attivano con: antigeni solubili; antigeni semplicemente adesi alla superficie delle cellule; peptidi solubili; peptidi adesi alla superficie delle cellule. Si attivano solo se il peptide è inserito nella tasca di una molecola MHC.

Genetica dell'MHC

Tre tipi di molecole codificate dal locus:

Polimorfismo

I geni del locus MHC sono i più polimorfici in natura: esistono nella popolazione moltissime varianti alleliche. La variabilità è concentrata negli esoni che codificano i domini che legano il peptide e le parti riconosciute dal TCR.

Poligenismo

Non c'è un solo gene per classe, ma tre:

Codominanza e aplotipi

Le molecole MHC sono espresse in maniera codominante: si esprimono sia gli alleli materni sia quelli paterni. L'insieme dei geni MHC ereditati in blocco da un genitore si chiama aplotipo. Ognuno ha due aplotipi, uno materno e uno paterno.

Conseguenza numerica: ogni cellula nucleata esprime 6 molecole MHC-I diverse (3 geni × 2 alleli). Per la classe II ci si aspetterebbe analogamente 6, ma se ne osservano 15–20: si ipotizza che, durante l'assemblaggio, le catene α e β si scambino fra loci diversi (per esempio la catena α di DP con la β di DQ), moltiplicando le combinazioni.

Perché tanto polimorfismo? La spiegazione evolutiva

Non serve al singolo individuo, serve alla popolazione. Se ognuno ha un corredo MHC diverso, è molto più probabile che qualcuno nella popolazione abbia una combinazione allelica capace di presentare un patogeno mai incontrato prima. Difficilmente potrà comparire un patogeno che nessun individuo della popolazione riesce a presentare. È una strategia per la sopravvivenza della specie, non del singolo.

Il locus MHC nell'uomo

Sul cromosoma 6, molto ampio, contiene anche geni della risposta immune e della processazione. Tre regioni:

Struttura delle molecole MHC di classe I

• Catena α — la più importante, codificata nel locus MHC, porta la tasca:
  • α1 + α2: all'estremità amminica, insieme formano la tasca, che ospita peptidi di 8–10 amminoacidi. È qui che si concentra il polimorfismo.
  • α3: dominio immunoglobulinico, non polimorfico — è quello legato dal CD8.
  • Regione transmembrana e piccola coda intracitoplasmatica.
• β2-microglobulina — non è legata alla membrana, è associata non covalentemente alla catena α e ha funzione di stabilizzarla. Non è codificata nel locus MHC.

La tasca: pavimento di foglietti β antiparalleli, bordi di α-eliche. Chiusa alle estremità: per questo può ospitare solo peptidi piccoli. Il peptide prende contatto in pochi punti, con gli amminoacidi detti "àncora", soprattutto alle estremità.

Struttura delle molecole MHC di classe II

• Due catene, α e β, entrambe codificate nel locus MHC, associate non covalentemente, che partecipano insieme alla formazione della tasca.
• La tasca si forma all'estremità amminica di α1 + β1. La variabilità maggiore è nella catena β1, il tratto più polimorfico.
• α2 e β2 sono i domini immunoglobulinici. Il β2, non polimorfico, è quello riconosciuto dal CD4.
• Entrambe le catene hanno parte transmembrana e coda citoplasmatica C-terminale.
• La tasca è aperta alle estremità: ospita peptidi più lunghi, di 10–30 amminoacidi.

Perché l'induzione da citochine è importante: l'aumento di MHC-I sulle cellule vicine all'infezione le rende capaci di "testimoniare" la presenza dell'infezione. L'IFN-γ prodotto dalle NK o dai CD4 attivati agisce sulle APC quiescenti, che aumentano la sintesi di MHC-II e diventano capaci di attivare massicciamente i linfociti T.

Le sei caratteristiche del legame peptide-MHC

1. Un peptide alla volta per ogni molecola MHC. Ogni linfocita T risponde quindi a un singolo peptide legato a una singola molecola MHC.
2. I peptidi sono incorporati a livello intracellulare, nel corso dell'assemblaggio — mai in superficie.
3. Le due classi legano peptidi provenienti da compartimenti diversi: vescicolare per la II, citosolico per la I.
4. Bassa affinità e alta promiscuità: la tasca lega il peptide in pochi punti, e ogni MHC può legare peptidi diversi purché nei punti di legame ci sia il giusto amminoacido àncora. Il peptide può essere ripiegato o modificato per entrare, ma deve agganciarsi in quei punti.
5. Tasso di dissociazione molto lento. È essenziale: i peptidi vengono captati in periferia e trasportati dalle cellule dendritiche fino agli organi linfoidi secondari; passa molto tempo prima dell'incontro con il linfocita T specifico, e il peptide deve restare in tasca per tutto quel tempo.
6. L'espressione stabile richiede il peptide: solo l'eterotrimero (catena α + catena β/β2m + peptide) è stabile e può raggiungere il plasmalemma. Senza peptide la molecola viene degradata.

Corollario: le molecole MHC classiche legano solo peptidi, perché i linfociti T classici rispondono solo ad antigeni proteici. Lipidi, carboidrati e acidi nucleici non possono essere caricati — per i lipidi c'è il CD1.

Le molecole MHC-I non classiche

HLA-G e HLA-E

• HLA-G: espresso sul trofoblasto fetale e sulla placenta. Sembra giocare un ruolo durante la gravidanza inibendo l'attivazione delle cellule NK, perché non montino una risposta contro il feto, che presenta antigeni diversi (paterni).
• HLA-E: scarsamente espresso, presente sul trofoblasto; riconosciuto dalle cellule NK (via NKG2A, inibitorio) e dalle NKT.

Le molecole CD1

• Cinque geni: CD1A–CD1E, sul cromosoma 1 (non nel locus MHC), polimorfismo molto limitato; codificano cinque proteine (CD1a–e).
• Si associano alla β2-microglobulina per stabilizzarsi e contengono lipidi nella tasca.
• CD1a, CD1b, CD1c legano prevalentemente lipidi microbici; CD1d sembra legare lipidi self.
• Espresse su cellule dendritiche e monociti.
• Antigeni presentati: lipidi e glicolipidi dei micobatteri e di altri microrganismi — lipidi micolici, fosfatidilinositolmannoside — o lipidi self.

Il ciclo del CD1

Esempi di patogeni: Mycobacterium tuberculosis, Leishmania. Il complesso lipide-CD1 attiva le cellule NKT, linfociti T non ristretti per MHC che non esprimono CD4 né CD8 e che, una volta attivate, producono molte citochine (fra cui l'IFN-γ) che regolano l'attivazione dei Th CD4 e delle altre sottopopolazioni.

MIC-A, MIC-B, ULBP

• MIC-A e MIC-B: codificate nel locus MHC, polimorfiche, espresse su cellule danneggiate, infettate e tumorali. Riconosciute dalle cellule NK (via NKG2D) e dai linfociti T CD8. MIC-A è espressa su cellule endoteliali, cheratinociti e monociti.
• ULBP: espressa su cellule trasformate e infettate, anch'essa riconosciuta da NK e T CD8.

Le APC professionali

Le cellule presentanti l'antigene professionali sono linfociti B, macrofagi/monociti e cellule dendritiche. Devono soddisfare almeno tre requisiti:

1. Capacità di captare l'antigene — per fagocitosi, pinocitosi o endocitosi.
2. Espressione di MHC-II.
3. Capacità costimolatoria nei confronti del linfocita T.

Tutte esprimono anche MHC-I, come ogni cellula nucleata.

Come l'antigene arriva all'organo linfoide

Gli antigeni entrano attraverso pelle, tratto gastrointestinale e tratto respiratorio, e da lì possono:

• Essere captati dalle cellule dendritiche, che migrano per via linfatica ai linfonodi ed espongono i peptidi;
• Entrare nel circolo ematico e raggiungere la milza, dove sono captati dalle APC;
• Arrivare al linfonodo in forma solubile, attraverso la rete linfatica afferente.

L'esempio della lezione: un microbo entra da una piccola ferita sul dorso della mano; le cellule dendritiche locali lo catturano tramite i PRR, maturano diventando sensibili alle chemochine linfonodali, e migrano al linfonodo ascellare, dove si confrontano con un numero elevatissimo di linfociti T vergini.

Le modalità con cui gli antigeni possono essere processati e presentati sono almeno tre:

• Antigeni peptidici extracellulari → fagocitati dalle APC → esposti in MHC-II → linfociti T CD4.
• Antigeni peptidici citoplasmatici → esposti in MHC-I → linfociti T CD8.
• Antigeni lipidici → esposti da CD1 → linfociti NKT.

Per farlo servono, coordinati: sintesi delle MHC nel reticolo endoplasmatico, transito per l'apparato di Golgi, e il sistema di vescicole secretorie ed endocitiche. Tutti i compartimenti intracellulari di endocitosi e secrezione hanno un ruolo.

Via MHC-I: i cinque step

1. Captazione dell'antigene — è una proteina citosolica.
2. Processazione — riduzione della proteina in piccoli peptidi da parte del proteasoma.
3. Trasporto dei peptidi nel RE, dove sta l'MHC-I.
4. Associazione del peptide all'MHC-I.
5. Trasporto del complesso in membrana, per essere visto dai linfociti T CD8.

Step 1 — ubiquitinazione

Tutte le proteine citoplasmatiche destinate alla degradazione — comprese quelle di un microbo intracellulare — vengono legate covalentemente a ubiquitina, un piccolo polipeptide, da un complesso enzimatico di subunità E1, E2, E3. L'ubiquitinazione induce la perdita della struttura terziaria: la proteina viene linearizzata.

Step 2 — proteasoma e immunoproteasoma

Il proteasoma è un grosso complesso enzimatico citoplasmatico con un core 20S di 28 subunità e due subunità regolatorie 19S. Taglia le proteine in peptidi di 6–15 amminoacidi, adatti alla tasca dell'MHC-I.

Alcune citochine infiammatorie — IFN-γ e TNF-α — trasformano il proteasoma in immunoproteasoma:

Perché conta: è stato dimostrato che le molecole MHC-I legano preferibilmente peptidi di 8–11 residui con residui idrofobici al C-terminale. L'immunoproteasoma produce quindi peptidi più affini alla presentazione antigenica: in corso di infiammazione la cellula ottimizza il proprio taglio proteolitico per la presentazione.

Step 3 e 4 — TAP e il complesso di caricamento

Nel RE, sul lato interno della membrana:

1. La catena α appena sintetizzata si associa a una chaperonina, la calnexina, che la mantiene parzialmente ripiegata.
2. La catena α si associa alla β2-microglobulina formando l'MHC-I maturo: la calnexina si stacca.
3. L'MHC-I si associa al complesso PLC (Peptide Loading Complex), formato da tre chaperonine: tapasina, calreticulina, ERp57.
4. TAP (Transporter associated with Antigen Processing) — eterodimero TAP1 + TAP2, trasportatore transmembrana ATP-dipendente — cattura il peptide sul versante citosolico e, consumando ATP, lo trasporta nel RE, dove è associato al PLC.
5. Grazie a tapasina, calreticulina ed ERp57, il peptide viene inserito nella tasca dell'MHC-I.

Step 5 — esposizione

Esplicata la funzione di facilitatore, il PLC si stacca: solo allora il complesso MHC-I/peptide può abbandonare il RE, transitare dal Golgi e raggiungere la superficie, dove diventa visibile ai linfociti T CD8.

Via MHC-II: catena invariante, CLIP, HLA-DM

Il problema che questa via deve risolvere: l'MHC-II viene sintetizzato nel RE, dove ci sono già molti peptidi di origine citosolica destinati alla via di classe I. Come si impedisce a un MHC-II di caricarsi del peptide sbagliato?

1. Nel RE vengono sintetizzate le catene α e β; la calnexina ne favorisce l'assemblaggio.
2. All'eterodimero viene associata la catena invariante (Ii), che contiene una sequenza chiamata CLIP, la quale occupa la tasca. La catena invariante polimerizza con altre due formando complessi di 3 MHC-II stabilizzati da 3 catene invarianti.
3. Grazie a questa stabilizzazione il complesso abbandona il RE, attraversa il Golgi e arriva nel citoplasma in vescicole di esocitosi.
4. Queste vescicole si fondono con gli endosomi/fagolisosomi che contengono l'antigene internalizzato. L'ambiente è acido per le pompe protoniche e ricco di proteasi, idrolasi e catepsina, che digeriscono sia l'antigene sia la catena invariante.
5. Digerita la catena invariante, nella tasca resta solo il peptide CLIP.
6. Interviene HLA-DM, molecola anch'essa fatta di catena α e β, appartenente al sistema MHC ma mai espressa in superficie: si associa all'MHC-II e scambia il CLIP con un peptide antigenico, scegliendo quello più affine. Questa funzione si chiama editing del peptide.
7. Solo quando l'MHC-II ha inserito un peptide affine si stabilizza e può essere esposto in superficie, dove attiva i T CD4.

La doppia funzione della catena invariante: (a) stabilizza la molecola e ne favorisce il trasporto al sistema vescicolare; (b) impedisce che peptidi presenti nel RE — derivati da proteine citoplasmatiche — si associino all'MHC-II, il che porterebbe a una presentazione scorretta. È il guardiano che tiene separate le due vie.

HLA-DO, il regolatore del regolatore

HLA-DO è sintetizzata nel RE insieme a HLA-DM, vi si associa, e ne regola negativamente l'attività: nei fagolisosomi si dissocia lentamente, liberando HLA-DM solo gradualmente.

Quando il sistema immunitario è attivato e viene prodotto IFN-γ, l'espressione di HLA-DM aumenta, mentre quella di HLA-DO no. Meno HLA-DO significa che la sua lentezza di dissociazione pesa meno: HLA-DM è libero di scambiare il CLIP più rapidamente e riempire più tasche. È un modo elegante di accelerare la presentazione durante l'infiammazione.

Immunodominanza

Dentro le cellule fagocitanti si formano moltissimi peptidi, ma solo i più idonei — detti epitopi immunodominanti — si legano all'MHC-II, grazie all'editing operato da HLA-DM. Conoscere quali siano gli epitopi immunodominanti è importante perché consente di manipolare il sistema immunitario (progettazione di vaccini peptidici).

Nota quantitativa: ogni molecola MHC-II diversa lega un peptide diverso derivato dallo stesso antigene. Poiché un individuo ne esprime fino a ~20 tipi, sulla superficie dell'APC si trovano fino a 20 peptidi diversi dello stesso antigene digerito.

Riepilogo: chi vede che cosa

Evasione virale

La risposta CD8 citotossica è essenziale contro le infezioni virali. Per questo alcuni virus producono molecole che interferiscono con i vari step della presentazione in MHC-I, per evitare l'attivazione dei CD8 e l'uccisione delle cellule infettate.

La regola del doppio segnale

La APC esprime le molecole co-stimolatorie solo quando è essa stessa attivata — da citochine infiammatorie o direttamente dal microbo, attraverso i recettori dell'immunità innata (cap. 14). Quando entrambi i segnali arrivano, il linfocita T si attiva, produce interleuchina 2, prolifera, si differenzia in cellula effettrice, e la risposta specifica parte.

La sinapsi immunologica

L'insieme delle molecole coinvolte nell'interazione fra linfocita T e APC:

La cascata di segnalazione

A valle della stimolazione di TCR, CD3, CD4 e CD28 si aprono tre vie abbastanza indipendenti:

I fattori traslocano nel nucleo e hanno come bersaglio principale i promotori di alcune citochine, fra cui l'interleuchina 2, fattore di crescita dei linfociti T. La cellula produce IL-2 e la usa per promuovere la propria proliferazione.

Cinetica dell'attivazione

Le due famiglie: B7 e CD28

Il circuito helper ↔ APC

È un circuito di amplificazione a due sensi: la APC accende il linfocita T, e il linfocita T finisce di accendere la APC.

I meccanismi effettori generali dei T helper

Sono due: produrre citochine ed esprimere segnali di membrana.

Le citochine cambiano ruolo secondo la fase:

• Fase di attivazione: i linfociti T sono bersaglio delle citochine infiammatorie, prodotte dalle cellule dell'innata, che ne favoriscono la polarizzazione e la proliferazione.
• Fase effettrice: sono i linfociti T stessi a produrre citochine, il cui scopo primario è attivare le cellule dell'innata, che poi eliminano il microbo.

Fra le molecole di membrana la principale è il CD40-ligando, che da un lato stimola le cellule dell'innata a produrre citochine pro-infiammatorie, dall'altro stimola i linfociti B a produrre immunoglobuline, in particolare nel processo di scambio isotipico.

Il sistema immunitario si è evoluto per organizzare, per ogni classe di microbi, la risposta adattativa più appropriata. Il meccanismo è sempre lo stesso: le cellule dell'innata "leggono" il patogeno, producono un certo set di citochine, e queste citochine polarizzano il linfocita T vergine che sta rispondendo all'antigene verso un fenotipo funzionale stabile.

Lo schema generale

Differenziazione Th1, passo per passo

1. Le APC, in risposta a microbi intracellulari, producono interferoni naturali e IL-12.
2. Queste due attivano le cellule NK, che producono IFN-γ.
3. L'IFN-γ agisce sulla cellula T naive che sta rispondendo all'antigene (dotata del recettore per IFN-γ) e attiva STAT1.
4. STAT1 va nel nucleo e attiva il promotore di T-bet, il fattore di trascrizione principale delle Th1.
5. T-bet attiva, fra i suoi geni bersaglio, la catena β2 del recettore per IL-12. Ora la cellula ha un recettore funzionale (β1+β2) e può rispondere all'IL-12.
6. L'IL-12 attiva STAT4, che stabilizza T-bet e innesca la prima produzione di IFN-γ.
7. Fenotipo Th1 maturo e stabile: alta produzione di IFN-γ.

Il network Th1

L'attivazione del macrofago da parte della Th1

Avviene con due segnali: IFN-γ + stimolazione del CD40 tramite CD40L. Il macrofago attivato mostra:

• Aumento delle molecole co-stimolatorie CD80 e CD86;
• Secrezione di citochine infiammatorie: TNF-α, IL-1, IL-12;
• Aumento dell'espressione delle molecole MHC → maggiore capacità di presentare l'antigene;
• Forte aumento della capacità microbicida, attraverso l'incremento degli intermedi reattivi dell'ossigeno e dell'ossido nitrico.

Si noti il circuito: il macrofago attivato produce IL-12, che rinforza la polarizzazione Th1, che produce più IFN-γ, che attiva di più il macrofago.

Patologie associate a risposte Th1 mal controllate

Le risposte Th1 sono altamente protettive contro i microbi intracellulari, ma quando non sono adeguatamente controllate — o quando sono rivolte verso antigeni self — causano patologie infiammatorie croniche, molte delle quali autoimmuni:

• Malattie autoimmuni organo-specifiche
• Artrite reumatoide
• Sarcoidosi
• Rigetto acuto di trapianto
• Alcune forme di aborti ricorrenti idiopatici
• Glomerulonefrite proliferativa
• Morbo di Crohn
• Ulcera peptica da Helicobacter pylori
• Aterosclerosi

Differenziazione Th2

Le Th2 difendono dai parassiti extracellulari, ma sono anche le protagoniste delle allergie.

1. Le cellule epiteliali, in risposta ad antigeni parassitari e ad allergeni, producono le allarmine: TSLP, IL-33, IL-25.
2. Il TSLP agisce sulle cellule dendritiche (che ne esprimono il recettore) riducendo la loro capacità di produrre IL-12 — cioè togliendo di mezzo il segnale che porterebbe verso Th1.
3. Le allarmine agiscono su ILC2, mastociti e basofili, inducendo la produzione soprattutto di IL-4, ma anche di TSLP e IL-25.
4. L'IL-4 agisce sulla cellula T helper naive che sta rispondendo all'antigene, attivando STAT6.
5. STAT6 fosforilato trasloca nel nucleo e attiva GATA-3, il fattore master delle Th2.
6. GATA-3 attiva i geni di IL-4 (che stabilizza STAT6) e di IL-2 (che attiva STAT5).
7. L'associazione di STAT5 e STAT6 stabilizza GATA-3, che attiva stabilmente i geni di IL-4, IL-5, IL-9, IL-13. Fenotipo Th2 stabile.

Il network Th2

Patologie associate a risposte Th2 mal controllate

• Varie forme di allergia, per esempio la congiuntivite primaverile
• Sclerosi sistemica progressiva
• Sindrome ipereosinofila idiopatica linfoide

Differenziazione Th17

1. Le APC (cellule dendritiche e macrofagi), in risposta a batteri extracellulari e funghi, producono IL-1β e IL-23.
2. La cellula T helper naive risponde fosforilando STAT3.
3. STAT3 trasloca nel nucleo e attiva RORγt (RORC), il fattore master delle Th17.
4. RORγt ha come bersagli una delle catene recettoriali dell'IL-23 (stabilizzandone l'espressione) e soprattutto il gene dell'IL-17.
5. La cellula produce IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-21: fenotipo effettore stabile.

Il network Th17

Il collegamento è netto: dove c'è una risposta Th17 c'è reclutamento di neutrofili, ed è per questo che la Th17 è la risposta contro batteri e funghi extracellulari — i patogeni che il neutrofilo sa fagocitare. È lo stesso concetto per cui la lezione 03 definisce i neutrofili "il braccio armato dei linfociti Th17".

Patologie associate a risposte Th17 mal controllate

Come per le Th1: malattie autoimmuni organo-specifiche, artrite reumatoide, sarcoidosi, morbo di Crohn.

A differenza dei T helper, che sono sorgenti di citochine per attivare altre cellule, i CTL hanno come bersaglio principale l'uccisione diretta delle cellule infettate da virus e di quelle trasformate in senso neoplastico.

Attivazione: vale sempre il doppio segnale

In entrambi i casi il CD8 attivato differenzia in cellula T citotossica terminale, capace di lisare le cellule che espongono peptidi virali in MHC-I.

I tre meccanismi effettori

Il macchinario è lo stesso delle NK (cap. 11): granuli citoplasmatici con perforina e granzimi, rilasciati all'attivazione. Cambia il modo di scegliere il bersaglio — recettore clonale MHC-ristretto per il CTL, bilanciamento di recettori monomorfi per la NK.

Classificazione dei CTL

Anche se la funzione principale è la citotossicità, negli ultimi anni si è dimostrato che i CD8 possono essere un'ottima sorgente di citochine. Sulla base di quali producono vengono classificati, in parallelo agli helper, in Tc1, Tc2, Tc17.

Analogamente, esistono CD8 con azione helper (produttori di citochine) e CD4 con potenziale citolitico: la corrispondenza CD4=helper / CD8=citotossico è una regola generale con eccezioni documentate.

Le risposte umorali sono quelle mediate da fattori solubili secreti nel plasma e negli altri liquidi biologici: le immunoglobuline prodotte dai linfociti B.

La fase effettrice richiede però la cooperazione dell'immunità innata: gli anticorpi si legano specificamente al patogeno, ma poi hanno bisogno di complemento, macrofagi, NK e mastociti per completare l'eliminazione. Questi elementi diventano così effettori dell'immunità specifica umorale.

Gli anticorpi naturali

Esistono anticorpi, detti naturali, presenti nel plasma dei mammiferi fin dalla giovane età, apparentemente senza esposizione ad antigeni estranei.

• Sono di norma IgM, raramente IgG o IgA.
• Hanno ridotta affinità e possono essere polireattivi (legano antigeni diversi).
• Sono prodotti dai linfociti B-1, CD5⁺, abbondanti nella mucosa intestinale.

L'esempio del sistema AB0

I globuli rossi portano in superficie antigeni glucidici associati alla membrana. Ogni gruppo sanguigno è caratterizzato dalla presenza nel plasma di anticorpi naturali contro gli antigeni che non esprime: un soggetto di gruppo A ha antigeni A sui globuli rossi e anticorpi anti-B nel plasma, prodotti entro qualche mese dalla nascita, quando certamente non ha mai incontrato globuli rossi di gruppo B.

La spiegazione: le strutture antigeniche del sistema AB0 somigliano a strutture presenti nei batteri intestinali. Ci immunizziamo verso gli antigeni batterici e, per reattività crociata, produciamo anticorpi verso l'antigene eritrocitario che non possediamo. È il motivo delle reazioni trasfusionali da sangue incompatibile.

Antigeni T-dipendenti e T-indipendenti

Attivazione del linfocita B: i segnali

Il BCR da solo non basta. Servono più segnali convergenti:

TLR nei linfociti B umani, per stadio

Conseguenze funzionali dell'attivazione del BCR

Il linfocita B naive attivato:

• Esprime proteine che promuovono sopravvivenza, proliferazione e ciclo cellulare.
• Esprime in superficie le molecole B7 (CD80/CD86): deve diventare a sua volta una APC, internalizzando l'antigene riconosciuto, processandolo ed esponendolo in MHC-II con le co-stimolatorie. È il passaggio indispensabile per associarsi al T helper.
• Aumenta i recettori per le chemochine, così da poter rispondere ai segnali del microambiente.
• Aumenta in particolare il CCR7, che gli consente di spostarsi dal follicolo primario verso l'area paracorticale ricca di linfociti T, seguendo il gradiente chemiotattico.

L'incontro a metà strada, dentro il linfonodo

Nel linfonodo i follicoli primari sono ricchi di B, l'area paracorticale di T e cellule dendritiche. L'antigene arriva e viene riconosciuto due volte, in modo indipendente:

• Nei follicoli, in forma nativa, dai linfociti B via BCR.
• In periferia, dalle cellule dendritiche, che lo processano e lo portano nell'area T presentando peptidi ai Th specifici, attivandoli.

Poi i due partner si vanno incontro, ciascuno cambiando recettore chemochinico:

Questo doppio movimento fa incontrare i due tipi cellulari al confine fra le due zone. Lì il Th CD4 attivato riconosce, sulla superficie del linfocita B diventato APC, il peptide antigenico: il linfocita B è così indotto a produrre anticorpi specifici per la proteina nativa che aveva riconosciuto col BCR.

La reazione extrafollicolare

Durante la migrazione verso il follicolo, il linfocita T esprime il ligando del CD40 (famiglia del TNF), che lega il CD40 dei linfociti B. Il legame è fondamentale sia per l'attivazione del B sia per la formazione dei foci extrafollicolari.

L'attivazione extrafollicolare è la prima risposta anticorpale:

• Produce anticorpi a bassa affinità, il cui scopo è limitare la diffusione dell'infezione.
• Genera plasmacellule a breve sopravvivenza, che non migrano nel midollo osseo.
• Gli anticorpi prodotti possono già andare incontro a scambio isotipico.
• Contribuisce alla formazione di nuovi centri germinativi contenenti Th.
• Si formano immunocomplessi, captati dalle cellule dendritiche follicolari, che serviranno a presentare l'antigene ai B attivati per selezionare i recettori più affini.

Il centro germinativo

Alcuni linfociti B tornano nel follicolo. La reazione del centro germinativo si verifica 4–7 giorni dopo l'attivazione.

Il ciclo può ripetersi: parte dei linfociti selezionati torna nella zona scura, continua a proliferare e mutare, e torna poi a "provare il recettore" nella zona chiara. È un processo di evoluzione darwiniana in miniatura: mutazione casuale + selezione per affinità.

Prodotti finali del centro germinativo:

• Plasmacellule a lunga vita (anche anni), che migrano nel midollo osseo e continuano a secernere anticorpi;
• Linfociti B della memoria.

Nota istologica dalla lezione: nel follicolo secondario, la zona scura è in basso e la chiara in alto; con marcatori specifici, l'anti-CD23 colora in verde e l'anti-Ki67 (marcatore di proliferazione) in rosso.

I linfociti T follicolari

Nella zona paracorticale, alcuni linfociti T attivati assumono caratteristiche particolari:

1. Esprimono il recettore ICOS, che lega l'ICOS-ligando sul linfocita B.
2. Questo aumenta i recettori per CXCL13 sul linfocita T, favorendone l'ingresso nel follicolo.
3. Dentro il follicolo il T esprime BCL6, che ne aumenta la sopravvivenza.
4. Il legame CD40–CD40L induce la proliferazione del B nel centro germinativo e stimola l'attivazione di AID, l'enzima che media sia la maturazione dell'affinità sia lo scambio isotipico.
5. Il Tfh produce IL-21, la citochina che sostiene tutti i processi follicolari.

Cinetiche della risposta umorale

Risposta primaria

Risposta secondaria (anamnestica)

Nella risposta secondaria resta anche una piccola componente di IgM, con le stesse caratteristiche della primaria: l'affinità delle IgM non aumenta mai, mentre quella delle IgG cresce con il numero di stimolazioni, soprattutto a basse dosi di antigene. La tabella di confronto completa è al capitolo 05.

Che cosa determina l'isotipo prodotto

Due variabili:

1. Le citochine dei linfociti T

L'IL-2 è il fattore di crescita prodotto localmente che fa proliferare il linfocita B attivato; le altre citochine indirizzano lo switch.

2. Il sito anatomico dell'attivazione

Il principio che le governa tutte

Il legame dell'antigene alla regione variabile provoca alterazioni conformazionali che si trasmettono alla porzione costante, cioè al frammento cristallizzabile. L'Fc così modificato diventa più affine per i recettori Fc e per le proteine del complemento.

1. Neutralizzazione

L'unica funzione effettrice interamente legata all'interazione con l'antigene: l'anticorpo si lega e basta, non servono altre cellule né altri meccanismi. Si ottiene con il solo frammento Fab; l'Fc è irrilevante, quindi la funzione è indipendente dall'isotipo.

Che cosa neutralizza

• Microrganismi: l'anticorpo si lega alla molecola con cui il microbo aggancia il recettore cellulare, prevenendo l'infezione della cellula. Esempi: l'emoagglutinina del virus influenzale; le proteine dei pili dei Gram negativi.
• Tossine: il microbo può anche non essere pericoloso di per sé, ma le tossine che rilascia danneggiano le cellule. Le tossine internalizzate inducono morte cellulare; anticorpi neutralizzanti le legano e ne impediscono l'ingresso. Esempi: tossina tetanica, tossina difterica.

L'applicazione terapeutica

Non richiedendo la cooperazione di altre componenti, la neutralizzazione ha azione pressoché immediata e si presta a terapie emergenziali:

• Siero antiofidico per l'avvelenamento da morso di serpente;
• Immunoprofilassi antitetanica in un soggetto non vaccinato a rischio;
• Anticorpi anti-botulino;
• Profilassi post-esposizione per il virus della rabbia;
• Gli anticorpi neutralizzanti dei soggetti immunizzati sono il concetto centrale della discussione sull'immunità al Covid, contemporanea alle lezioni: solo un anticorpo neutralizzante impedisce al virus di entrare nelle cellule.

2. Opsonizzazione e fagocitosi

Opsonizzare significa letteralmente "preparare al pasto": rivestire il microbo di anticorpi specifici lo rende molto più facilmente fagocitabile.

I fagociti — macrofagi e granulociti neutrofili — esprimono i recettori per l'Fc delle IgG (in particolare FcγRI): possono così legare e internalizzare rapidamente l'antigene opsonizzato.

La fagocitosi esiste anche senza anticorpi, nei primi momenti della risposta, ma è molto meno efficiente. L'opsonizzazione stimola inoltre la capacità battericida del fagocita, per esempio aumentando la produzione di radicali.

3. Citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC)

Gli eosinofili sono le uniche cellule capaci di distruggere la parete di questi parassiti, grazie al contenuto dei loro granuli.

4. Attivazione del complemento

Via classica, perché mediata da anticorpi adesi sulla superficie del microrganismo.

In tutti i casi è necessario che l'anticorpo sia legato all'antigene, perché serve il cambio conformazionale che rende l'Fc accessibile a C1q.

5. Sensibilizzazione di mastociti, basofili ed eosinofili

Queste cellule portano il recettore ad alta affinità per le IgE, FcεRI, che riconosce l'Fc delle IgE anche quando non è legato all'antigene — l'eccezione alla regola generale enunciata a inizio capitolo.

Il meccanismo dell'allergia

I mediatori rilasciati

Va ricordato che la funzione fisiologica delle IgE è la difesa dalle parassitosi, in particolare da elminti: l'allergia è quello stesso meccanismo, rivolto verso un antigene innocuo.

I recettori per il frammento Fc

Tutti appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline.

Feedback anticorpale: come si spegne la risposta umorale

L'ultima funzione dei recettori Fc è la regolazione negativa della risposta, ed è affidata al FcγRIIB espresso dai linfociti B.

Il senso è economico: quando in circolo c'è già abbastanza anticorpo specifico, quello stesso anticorpo — legandosi all'antigene e al recettore inibitorio sul linfocita B che lo sta ancora riconoscendo — segnala alla cellula di smettere di produrne. È un termostato molecolare, e uno dei meccanismi della fase di declino.

Come è protetto il neonato

Alla nascita e durante la vita fetale il sistema immunitario del neonato non è efficiente: è ancora immaturo e deve svilupparsi. La protezione è quindi passiva, fornita dalla madre, per due vie:

Il recettore neonatale FcRn

Il trasporto delle IgG attraverso la placenta e l'epitelio intestinale del neonato è mediato da un recettore specifico per l'Fc delle IgG, il recettore neonatale (FcRn).

• Struttura: una catena omologa all'MHC di classe I, associata alla β2-microglobulina.
• Stechiometria: due molecole di recettore trasportano una molecola di IgG, legandosi all'interfaccia fra il dominio costante 2 e il dominio costante 3 (CH2-CH3).
• Sedi: placenta — media il trasporto degli anticorpi dalla madre al feto; cellule endoteliali.
• Funzionamento: capta le IgG, le internalizza, e ne permette l'attraversamento della cellula. Una volta dentro, le IgG sono protette dalla degradazione.

Corollario: le IgG che non legano l'FcRn non raggiungono il feto — non riescono a oltrepassare le cellule della placenta — e hanno vita molto breve.

Immunità secretoria: le IgA

A livello delle mucose le plasmacellule producono IgA dimeriche e le rilasciano nella sottomucosa, dove si trovano i follicoli e gli organi linfoidi secondari mucosali. Da lì devono raggiungere il lume, perché la loro funzione è bloccare i microrganismi prima che entrino nell'organismo.

La transcitosi

Il processo si chiama transcitosi, appunto perché l'anticorpo attraversa tutta la cellula epiteliale dentro una vescicola.

• Le IgA sono la principale classe prodotta a livello mucosale: rappresentano il 60–70% della produzione totale giornaliera di immunoglobuline.
• Compito nelle secrezioni: neutralizzare e bloccare l'ingresso di batteri e tossine.

Se c'è una struttura che tiene insieme l'intero corso, è questa: il sistema immunitario non ha una risposta, ne ha tre, ciascuna calibrata su una classe di patogeni, e ciascuna con una versione innata e una adattativa che usano le stesse citochine e attivano le stesse cellule effettrici.

La linea del tempo di un'infezione

Le sette coppie da non confondere

Tutti i punti in cui le sbobine dicono qualcosa di sbagliato, contraddittorio o superato, raccolti in un unico posto. Le prime tredici voci sono errori veri: se li ripeti così come sono scritti, sono sbagliati. Le successive sono imprecisioni, dati datati o contraddizioni fra lezioni.

Errori concettuali

Refusi e scambi di termine

Contraddizioni interne fra lezioni

Dati datati o al limite

Le sbobine rimandano più volte ad argomenti "che vedremo in seguito" e che nelle undici lezioni disponibili non compaiono. Non sono lacune di questa ricostruzione: sono le lezioni successive del modulo. Qui sotto trovi, per ciascuno, il punto in cui viene promesso e uno schema minimo per non arrivarci del tutto scoperto.

Tolleranza immunologica

Promessa in: lez. 02 ("questo tema verrà ripreso in seguito"), lez. 05 (tolleranza centrale), lez. 09 (CTLA-4 e PD-1 "verranno trattati quando verrà affrontata la tolleranza").

Reazioni di ipersensibilità

Promessa in: lez. 03 e lez. 11 ("lo rivedremo quando tratteremo le reazioni di ipersensibilità"). Classificazione di Gell e Coombs:

Trapianti e rigetto

Toccato in: lez. 01 (trapianto di midollo, immunoablazione), lez. 08 (tipizzazione HLA, esperimenti sui ceppi singenici), lez. 09 (rigetto acuto associato a Th1).

• Alloriconoscimento diretto: i T del ricevente riconoscono direttamente le molecole MHC del donatore sulle APC trapiantate — è la ragione della violenza del rigetto acuto (fino al 2% dei T è alloreattivo).
• Alloriconoscimento indiretto: le APC del ricevente processano proteine del donatore e le presentano come peptidi.
• Rigetto iperacuto (minuti, anticorpi preformati), acuto (giorni-settimane, T-mediato), cronico (mesi-anni, fibrosi e vasculopatia).
• GVHD (graft versus host disease): il rovescio, tipico del trapianto di midollo — sono i linfociti del donatore ad attaccare il ricevente.

Immunodeficienze

Toccate a frammenti in quasi tutte le lezioni: MyD88, NEMO, IκBα, RAG, Artemis, DNA-PK, C3, C9, C1-INH, complemento.

Immunità antitumorale

Toccata in: lez. 01 (CAR-T, neoantigeni), lez. 03 (vaccini a DC nel melanoma), lez. 03 e 11 (ADCC come terapia), lez. 09 (famiglia PD-1/PD-L1).

• Immunosorveglianza e immunoediting: eliminazione → equilibrio → escape.
• Meccanismi di fuga: perdita dell'MHC-I (e conseguente vulnerabilità alle NK), espressione di PD-L1, reclutamento di Treg e cellule soppressorie.
• Terapie: checkpoint inhibitors, CAR-T, anticorpi monoclonali (ADCC), vaccini a cellule dendritiche.

Infiammazione

Promessa in: lez. 11 ("l'istamina… verrà trattata quando verrà trattata l'infiammazione"). È il capitolo di Patologia Generale in cui confluiscono complemento, citochine, mediatori mastocitari, essudato e riparazione — tutti argomenti già presenti in queste lezioni ma non ancora messi in sequenza.

Sigle ricorrenti

Termini che nelle sbobine compaiono senza definizione

Ricostruito dalle sbobine di Immunologia dei canali A–B, AA 2019/20 — proff. Francesco Annunziato e Daniela Monti, corso di Patologia Generale. Undici lezioni, dal 3 marzo al 17 aprile 2020. Il contenuto delle lezioni è riportato integralmente; correzioni e integrazioni sono segnalate come tali e raccolte nel capitolo 36.